[发明专利]生产人血管生成抑制素的方法

说明书

本发明提供在大肠杆菌中表达截短的人血管生成抑制素(AGN K1-3)蛋白的方法，特别是提供包括AGN K1-3编码序列及与之融合的大肠杆菌热稳定性肠毒素信号序列(STⅡ)和大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)启动子的表达载体，被所说的表达载体转化的大肠杆菌细胞及以高水平产生正确拆叠并加工的生物学活性AGN多肽的方法。

七十年代初，Folkman基于其研究结果，提出了通过抑制血管生成来治疗实体肿瘤的概念(Folkman J.,Am.Surg.175:409-416；1972)。近20年来，随着血管生成体外研究方法的建立和完善，已发现了多种血管生成因子(AGF)和血管生成抑制因子(AIF)，并证明了肿瘤生长和转移对血管生成的依赖关系。例如有人发现，在肿瘤形成的血管前期，肿瘤只能依靠自由扩散获取营养，当肿瘤形成了自身的血管系统，即进入血管期后，肿瘤便迅速生长并开始远距离转移(Gimbrone,MA.et al.,J.Exp.Med.,73:461-473,1972)。另外发现，腹腔内注射bFGF(Hori,A.et al.,Cancer Res.,51:6180-6184,1991)或血管内皮生长因子(VEGF)可促进肿瘤血管生成，并增加肿瘤血管的密度，而抗bFGF或抗VEGF抗体则可抑制肿瘤细胞的生长和转移(Kim KJ,et al,Nature(London)362:841-844,1993))。

血管生成不仅是肿瘤生长所必需的，而且肿瘤细胞与新生血管系统的接触还是导致肿瘤远距离转移的重要原因(Blood  and Zetter,PNAS,1032:89-118,1990)。转移时，肿瘤细胞从原发灶脱落并穿越基底膜进入血管，逃避免疫监视并在循环系统中存活，然后定位于靶器官的微血管并进入靶器官，进而诱发转移灶内的血管生成。因此，血管生成是转移过程起始和终止所必需的。

血管生成是一个极其复杂的生理过程，并受到多种血管生成因子和血管生成抑制因子的调节。已知的血管生成因子包括bFGF、VEGF、PD-ECGF、HGF及IL-8等。已知的血管生成抑制因子包括IFN-γ、TBS-1、PE-4等。这些因子在血管生成过程的不同环节相互协同或制约，维持正常血管生成及其调节机制。在肿瘤发生中，血管生成可能是血管生成刺激因子与抑制因子在量和作用效率上失平衡的结果(Folkman J,Semin.Cancer Biol.,3:65-67.1992)。

因此，有可能基于肿瘤组织血管化程度和血管生成因子、血管生成抑制因子及内皮细胞粘附分子等活性分子水平的检测，对肿瘤进行辅助诊断和预后分析。根据肿瘤组织血管生成中肿瘤细胞与内皮细胞之间的关系，有可能通过下述四种途径抑制肿瘤血管生成，达到抑制肿瘤生长的目的：1)抑制肿瘤血管生成因子的分泌；2)阻断肿瘤血管生成因子的活性；3)阻止肿瘤血管生成因子诱导的血管内皮细胞的有丝分裂；4)阻止血管长入肿瘤组织。

O’Reily等人在研究实体肿瘤原发灶被切除后转移瘤生长更加迅速这一现象的分子机理时，从肿瘤模型动物的血清和尿中分离并纯化得到一种具有特异性血管内皮细胞增殖抑制活性的，定名为“血管生成抑制素”(AGN)的蛋白质(O’Reilly MS,et al.,Cell 79:315-328,1994)。氨基酸序列分析结果显示，小鼠AGN与小鼠纤溶酶原(PLG)蛋白的一个内部片段即氨基酸序号98至440具有98％的同源性，并相当于PLG结构中的Kringke 1至4区(K1-4)。进一步地研究证明AGN对血管内皮细胞的生长具有特异抑制活性，并发现用胰弹性蛋白酶水解人PLG(hPLG)后所得到的K1-4片段同样具有抑制体外培养的毛细血管内皮细胞增殖的活性。一些体内试验研究结果也证明了该生物学活性蛋白的肿瘤生长及肿瘤转移抑制作用(Fidler IJ.and Ellie LM,Cell 79:185-188,1994)。