[发明专利]一种重组胸腺素α1及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1及其制备方法。

背景技术：

胸腺素α1(thymosinα1，简称Tα1)是一个由28个氨基酸残基组成的多肽，具有免疫活性，临床上多用于治疗病毒性肝炎。天然Tα1的氨基酸序列为NH₂-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH，N端为乙酰化[Goldstein A L，Low T L，McAdoo M，McClure J，Thurman GB，Rossio J，Lai C Y，Chang D，Wang S S，Harvey C，Ramel A H，Meienhofer.J.Thymosin alpha 1：isolation and sequence analysis of an immunological active thymic peptide.Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(2)：725～729]。目前Tα1单体只有一种来源，即采用固相合成法全合成，成本高，易造成环境污染。至今国内临床所用均为国外进口合成Tα1制剂，由于制备工艺成本高，故售价昂贵，如美国Sciclone公司生产的Zadaxin(中文名为日达仙)国内零售价高达900元/1.6毫克。

发明内容：

本发明采用基因工程技术制备重组胸腺素α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点。我们采用融合表达的方法来制备重组胸腺素α1，包括：(1)融合表达载体的构建；(2)大肠杆菌工程菌的发酵；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。在构建表达载体时，以5′-G G G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′为上游引物(内含BamHI酶切位点/G G A T C C)、5′-G G G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′为下游引物(内含EcoRI酶切位点/G A A T T C)，以人胎盘cDNA为模板进行PCR，扩增出目的基因片段，随后通过EcoRI/BamHI双酶切将目的基因定向克隆到质粒pGEX-4T-1上，所构建的融合表达载体为pGEX-4T-1/Tα1。融合表达载体pGEX-4T-1/Tα1转化大肠杆菌后获得的工程菌可表达出谷胱甘肽硫转移酶(GST)与胸腺素α1(Tα1)的融合蛋白GST-Tα1，在GST与Tα1之间有凝血酶的酶切位点，融合蛋白经凝血酶酶切后，产生由羧基端29个氨基酸残基组成的多肽，即重组胸腺素α1。该重组胸腺素α1仅比由28个氨基酸残基组成的天然Tα1在N端前增加了一个甘氨酸，用Gly-Tα1表示。Gly-Tα1具有与天然Tα1相当的生物活性，由于甘氨酸是所有氨基酸中最简单、分子量最小的氨基酸，因此Gly-Tα1不易产生免疫原性。本发明制备方法简单，成本低廉，且不会造成环境污染。

Gly-Tα1的制备方法如下：

以人胎盘cDNA为模板进行PCR，其产物经胶回收，EcoRI/BamHI双酶切，与pGEX-4T-1载体连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，经酶切、测序、鉴定后得到工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1。该工程菌采用分批补料培养技术进行发酵，以终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导3～5小时，终止发酵，收获菌体。按每克湿菌加入10ml的比例加入超声缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清用Glutathione Sepharose 4B柱进行亲和层析纯化融合蛋白。将GST-Tα1融合蛋白对酶切缓冲液透析，按每单位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反应2～16小时。将凝血酶酶切的裂解液过GlutathioneSepharose 4B柱，收集穿过峰，对50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ阴离子交换柱，用0～1mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集主峰。纯化出的Gly-Tα1纯度大于90％，表观分子量为3.1KD。

具体实施方式：