[发明专利]用于纯化含咕啉分子的方法

说明书

在本发明中引用的所有专利和非专利文献均在此以全文引入作为参考。

发明领域

本发明涉及一种亲和性吸附剂材料(affinity adsorbent materials)，其包含能与含咕啉化合物例如钴胺素(CbI，或维生素B₁₂)结合的高度-特异性官能团。本发明还涉及制备这种吸附剂材料的方法，以及在纯化含咕啉分子如钴胺素中的用途。还提供了通过该方法纯化的包含钴胺素的组合物。

发明背景

维生素B₁₂(或钴胺素，CbI)是哺乳动物的两个重要过程中涉及的生物学辅助因子：将高半胱氨酸修复为蛋氨酸以及将丙酸转化为琥珀酸盐(1)。所有的哺乳动物均依赖于外源的B₁₂，这是由于其仅仅由微生物进行合成(2)。食草动物从各种寄居在其肠系统的大量细菌中获得CbI。其它动物，包括人类，从动物源如肉、奶和蛋中获得维生素(3，4)。缺乏B₁₂将导致严重的病症，包括神经学上的异常以及贫血(4，5)。CbI是辅助因子中最复杂的分子(图1)，并且包括三个部分：

1)具有中心钴原子的类咕啉环，

2)在较低的轴位置([α]-位)通过其碱基与钴配位的核苷酸环，

3)在较高的轴位置([β]-位)与钴配位的[β]基团。

产生B₁₂微生物同时合成钴胺素及其类似物，该类似物在其结构上与B₁₂不同并且在哺乳动物细胞中不具有催化功能(2，6)。最典型的类似物是具有错误核苷酸碱基的类咕啉(例如假B12，A因子)或者缺失了部分分子(例如钴啉醇酰胺)。钴胺素合成的各种中间产物属于后者。所有的钴胺素和大部分类似物是具有特征吸收光谱的有色物质，这简化了其浓度的测定并使不同的咕啉环(6)彼此区分。

具有正确骨架的生物活性的CbI可以包含不同的在[β]-位(图1)上与钴原子配位的上部轴基团。最常见的[β]-基团是：甲基、脱氧腺苷、氰化物、水以及一些其它的有机和无机化合物(6)。具有正确骨架的CbI的所有形式(不论其[β]-基团的性质)可以被细胞中的酶转化为具催化活性的辅助因子甲基-或脱氧腺苷-钴胺素(CbI-Met，CbI-Ado)(3)。在这一转化中CbI的中间体形式为含水-CbI(aquo-CbI)(CbI-OH₂，维生素B_12a)。因此，CbI-OH₂、CbI-Ado和CbI-Met是来自任何天然来源的普遍存在的钴胺素(3，4，7)。CbI的氰基形式(CbI-CN)是工业纯的典型产品，并也被称为维生素B₁₂。

CbI的制备是已有良好建立的方法，其包含一系列使得活性物质从细菌混悬液中分离的步骤(8，9)。虽然该精确的细节并不为公众所获得，但是其主要的步骤可被假定为：1)发酵；2)添加氰化物的细胞的热解作用；3)在基质如木炭上的小有机分子(包括CbI)的非特异性吸附；4)在其它树脂如疏水性吸附剂XAD上的洗脱和吸附；5)用苯酚从水相中洗脱和萃取CbI；6)用水-丙酮混合物从苯酚中萃取CbI；7)干燥；8)溶解在热水中并在室温从丙酮-水溶液中结晶；9)最后的干燥。纯化的产品为CbI-CN(维生素B₁₂)，但是CbI-OH₂(维生素B_12a)的制备需要其它的化学处理和再纯化。

上述过程采用了一系列用来分离的非特异性步骤。相反，也当然可以利用CbI的特有特征，即，在[β]-位与某些化合物配位的能力。例如，具有偶合的[β]-特异性基团的基质可以被用来从溶液中萃取CbI。这意味着技术人员可以仅在一个步骤中从粗萃取物中纯化维生素。成功实施这一方法是值得期待的，这是由于在来源介质中的CbI具有弱结合的轴上部的配基，该配基可以被与吸附剂结合的基团所代替。