[发明专利]构建具有美伐他汀羟化能力的菌株的方法

说明书

                    相关申请

本申请要求2004年12月3日提交的美国临时申请第60/633,011号的权益，所述临时申请通过引用结合到本文中。

                    发明领域

本发明涉及与编码P-450细胞色素及其活性所必需的基因有关的新蛋白质fdxshe或fdxshe-样蛋白。本发明涉及基于微生物制备普伐他汀的方法和组合物。本发明的组合物包括含该基因的载体、这种载体在表达系统中的应用和能够有效地使美伐他汀(ML-236B)羟化制备普伐他汀的微生物新菌株。特别是，本发明的微生物经过基因工程，表达细胞色素P-450和新发现的fdxshe或fdxshe-样蛋白两者。本发明还涉及这种微生物在设计用于制备普伐他汀的方法中的用途，普伐他汀用于治疗例如高胆固醇血症和高脂血症的疾病。

                    发明背景

普伐他汀是HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)抑制剂，HMG-CoA还原酶是胆固醇生物合成的关键酶。该酶显著降低血浆胆固醇和脂质水平，因此在治疗高胆固醇血症和高脂血症中具有非常重要的药理学作用。[Serizawa等，J.Antibiot，36：887-891(1983)；Serizawa等，J.Antibiot，36：918-920(1983)；Serizawa等，J.Antibiot，36：604-607(1983)；Tsujita等，Biochim.Biophys.Acta，877：50-60(1986)；Arai等，Ann.Rep.Sankyo Res.Lab.，40：1-38(1988)；和Koga等，Biochim.Biophys.Acta，1045：115-120(1990)。]

通过ML-236B(美伐他汀)钠的微生物羟化作用获得普伐他汀，ML-236B(美伐他汀)是由丝状真菌桔青霉(Penicillium citrinum)制备的物质。许多不同属的真菌例如根毛霉属(Mucor Rhizopus)、共头霉属(Syncephalastrum)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、被孢霉属(Mortierella)和细菌例如诺卡氏菌属(Nocardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)可以有不同程度的这种羟化作用，如各专利所述。[美国专利第5,179,013；4,448,979；4,346,227；4,537,859；6,566,120；6,750,366号；加拿大专利第1,150,170；1,186,647号；日本专利第58-10572号；和欧洲专利第0605230号]

所述羟化发生在ML-236B的6-位，由发现于嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)的细胞色素P-450_sca单加氧酶系统催化[Matsuoka等，Eur.J.Biochem，184：707-713(1989)；和Serizawa等，Biochimica et Biophysica Acta，1084：35-40(1991)]。细胞色素P-450_sca的特征在于存在三种形式：P-450_sca-1、P-450_sca-2和P-450_sca-3，根据美国专利第5,179,013号，其适用于羟化方法。

Serizawa等从嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)克隆编码P-450_sca-2的DNA[日本专利特许公开第6-70780号；和Watanabe等，Gene，163：81-85(1995)]。该基因具有1233bp的可读框，编码410个氨基酸的蛋白质[Watanabe等，Gene，163：81-85(1995)]。将2.8kbDNA插入片段连同P-450_sca-2基因的5′-非编码区的1kbp部分一起克隆到多拷贝质粒pIJ702内，用于转化浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)TK21。已转化的浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK21甚至比嗜碳链霉菌(S.carbophilus)更快地将ML-236B转化成普伐他汀。见Watanabe，I.等，Gene，163：81-85(1995)。