[发明专利]一种凝血酶的提取分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说涉及一种凝血酶的提取分离方法。

背景技术

凝血酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，它催化纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，使之变为不溶性的血纤维蛋白，从而促使了血液的凝固。国内外对其作了大量的研究，并已作为一种新型速效局部止血药，应用于临床。一般提取分离方法是乙醇、丙酮和乙醚等的有机溶剂法，柠檬酸钡吸附法和氢氧化镁吸附法等。它们将其制备成凝血酶或凝血酶原的粗制品，然后再通过离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等方法将其纯化、冻干获得了纯度较高的凝血酶，但是由于其制备工艺流程复杂，技术要求高，成本昂贵，不易广泛使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝血酶的提取分离方法，采用CaCl₂激活凝血酶原成为凝血酶的同时加入(NH₄)₂SO₄，使其生成CaSO₄沉淀吸附凝血酶，以简化其生产工艺流程，缩短后续纯化的周期和降低成本。

本发明有下述顺序的步骤：

a、以牛血液或猪血液为原料，在此血液中加入3.8％ W/V的柠檬酸钠作为抗凝剂，搅拌均匀，然后用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆；

b、将获得的血浆用去离子水以体积比稀释9～10倍，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在4～5℃下，静置10～12小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀；

c、将获得的凝血酶原沉淀，用含1.5％～2.0％ W/V CaCl₂的去离子水溶解，在4～5℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液；

d、将获得的上清液放在37℃水浴中搅拌，加入10％～15％ W/V(NH₄)₂SO₄，生成CaSO₄沉淀吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟左右，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物；

e、将收集的沉淀物用pH值为7.30的0.9％W /V生理盐水洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液；

f、将获得的凝血酶溶液用超滤器对其进行浓缩，冷冻干燥，获得白色的凝血酶冻干粉。

本发明的优点是：提取方法简便易行，易于工业化生产。在用CaCl₂激活凝血酶原成为凝血酶的同时，加入(NH₄)₂SO₄使其生成CaSO₄沉淀吸附凝血酶，不通过离子交换层析和亲和层析等复杂步骤，而直接经过洗脱，超滤和冻干步骤，这样节省了成本和提取时间，由原来约需的7天时间缩短到2～3天。每立升血液可获得冻干凝血酶粉0.7g左右，其比活力约为100U/mg(蛋白)。

具体实施方式

实施例1

本发明有下述顺序步骤：

a、首先取牛血液1000mL为原料，在此血液中加入3.8％ W/V的柠檬酸钠作为抗凝剂，搅拌均匀，在4℃以下用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆。

b、用去离子水将获得的血浆以体积比稀释9倍，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在4℃下，静置10小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀。

c、将获得的凝血酶原沉淀，用含1.5％ W/V CaCl₂的去离子水300毫升溶解，在4℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液。

d、将获得的上清液置于37℃水浴中搅拌，在搅拌的同时，缓慢地加入10％ W/V的(NH₄)₂SO₄，使其与Ca⁺⁺起化学反应，生成CaSO₄沉淀吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟左右，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物。

e、将收集的沉淀物用100毫升pH值为7.30的0.9％ W/V生理盐水洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液。