[发明专利]利用超滤进行病毒纯化

说明书

技术领域

本发明涉及病毒制备的领域，更具体地，涉及用于制备疫苗或基因治疗产品的病毒的纯化，由此得到疫苗和基因治疗产品。

背景技术

病毒，不论是天然的还是重组形式，都可用于疫苗接种和基因治疗领域。许多病毒或者类似病毒的颗粒可以安全而有效地在细胞中繁殖(如WO 01/38362，描述了在E1-永生化视网膜细胞中培养各种病毒)。重组腺病毒是基因治疗和免疫接种中的一类优选的病毒载体。这种重组腺病毒通常缺乏至少E1区域，可以在提供E1区域的互补细胞中繁殖，例如293细胞，或者E1-永生化视网膜细胞，例如PER.C6^细胞(见美国专利5,994,128)。

病毒在细胞内繁殖后，对于几乎所有应用，在进一步使用前，必须先对病毒进行纯化。

国际专利项目WO 98/22588描述了生产和纯化腺病毒载体的方法。方法包括使细胞生长，用腺病毒感染细胞，收获并裂解细胞，浓缩裂解液，置换裂解液缓冲体系，用核酸酶处理裂解液，以及进一步用层析方法纯化病毒。

其他一些文献也描述了从细胞中纯化病毒的方法，大部分是讨论用特殊的层析介质从细胞裂解液中纯化病毒，见美国专利申请6,008,036、6,586,226、5,837,520、6,261,823、6,537,793和国际专利申请WO 00/50573、WO 02/44348和WO 03/078592。

在一些纯化病毒的工业化工艺中，特别是对于那些腺病毒，通常使用了超滤步骤，主要是用于浓缩病毒并置换保存有病毒的缓冲液。

尽管目前已经有关于几种主要针对不同层析介质的纯化工艺的描述，对于病毒的纯化，仍然需要有其它可以选择并且优选改进的方法。本发明就提供了这样一些方法。

附图说明

图1.已知的细胞收获方法(T/B)和本发明中的方法(B/T)的对比图解，见例1。T：Triton，B：Benzonase。p.i.：感染后。

图2.T/B法或B/T法之后，澄清时宿主细胞蛋白的去除。的对比(图解见图1)。图中显示5份独立的纯化处理样品的银染SDS-PAGE(4-12％bis-tris NuPAGE，Invitrogen)分析(样品见例1和表1)。图2为T/B收获产物，其中裂解先于核酸酶的添加；图3-7为B/T收获产物，其中核酸酶的添加先于裂解。收获物(泳道1)用0.5μm的Clarigard过滤器澄清过滤(泳道2)，接着用0.8/0.45μm的Sartopore 2过滤器过滤(泳道3)。M：标记物，分子量单位kD。

图3.病毒纯化方法的图解(见实施例1；也见于PCT/EP2005/050739)。

图4.低纯度TFF渗余物(retentate)样品(A)和高纯度TFF渗余物样品(B)的RP-HPLC图谱。详见实施例2。

图5.低纯度TFF渗余物样品(A，TFF过程中无背压)和高纯度TFF渗余物样品(B，TFF过程中有背压)的阴离子交换洗脱图谱。详见实施例2。

图6.跨膜压力(TMP，图A)效果的统计分析和每滤过面积(图B)的进液量。详见实施例2。

图7.回收腺病毒时施加背压到渗透物侧的统计分析。详见实施例2。

图8.TFF实验的图解表示。A.在渗透物侧无背压(符合本技术领域状况的病毒纯化TFF)。B.在渗透物侧有背压(本发明的病毒纯化TFF)。P_o：P_out，P_i：P_in，P_p：P_perm。见实施例3。

图9.无背压时的对照TFF(A)的流量和本发明中有背压时TFF(B)的流量。详见实施例3。

图10.TFF渗余物的SDS-PAGE。1：标记物，2：A实验(无背压对照)，3：B实验(本发明中的有背压实验)。4：CsCl纯化的Ad35.详见实施例3。

图11.TFF渗余物的RP-HPLC分析。A.无背压(对照)。B.有背压(本发明)。详见实施例3。

图12.从20L裂解液中用带背压的TFF获得的渗余物的SDS-PAGE分析。除了条带2外的所有条带都含有5E9的病毒粒子。1：澄清后的病毒。2：5倍浓缩后的渗透液。3：渗滤过的病毒。4：捕获的病毒(MustangQ阴离子过滤后)。5：预先配比后的原液(基团分离和除菌过滤后)。6：标记物。详见实施例4。