[发明专利]用于转染细胞代谢性选择的组合物和方法

说明书

相关申请的交叉引用

该申请在基于美国专利法35.U.S.C.§119(e)上要求对2005年5月18日申请的美国临时申请系列号60/681,969的优先权，在此全部收录作为参考。

技术领域

本发明涉及新的标记选择载体以及使用这些载体在真核细胞内稳定表达基因产物的方法。

背景技术

哺乳细胞体外培养技术的发展对生物研究有着革命性的意义。细胞培养技术可以用来评价处于发展前期的药物的毒性或者效应，药物发展前期使用人体临床试验具有很高的风险。细胞培养技术也可用来产生治疗用途的复杂人体蛋白例如单抗，也可用做细胞基础上治疗的平台。这些细胞培养技术包括成人和胚胎干细胞的体外培养。另外，在体外细胞培养系内引入杂和性重组DNA是科学家探索动物系统试验的有力辅助工具。

最近，对于用来表达生物分子进而产生治疗用药物的细胞系可能存在的污染问题的调控需求更加重要。整个生物技术业不再使用含有胎牛血清的培养液，从而达到避免由未来生物手段引起的潜在动物病原体或者可能治病的动物蛋白被引入人体的可能性。无血清培养液日益成为体外培养哺乳细胞的标准程序，特别是对那些用于基因表达和蛋白质纯化的制备体系。

NS-0小鼠骨髓瘤细胞系是一个常用的蛋白质表达系统，例如Lonza′s GS基因表达系统(Lonza Group，Basel，Switzerland)。这个系统利用了在细胞液中不添加谷氨酸的情况下NS-0细胞本身不能产生存活所必需的谷氨酸这一特性，使用谷氨酸合成酶作为质粒载体细胞转染的选择标记。

NS-0细胞也能产生胆固醇营养缺陷，从而导致细胞培养液中必须同时加入胆固醇和谷氨酸以支持本细胞系的生长。在细胞培养液内加入胆固醇是一个复杂的耗时巨大的过程，这是因为脂质必须与糖分子(例如环糊精)相互偶联以增加其在水溶液中的溶解度。另外，偶联过程本质上不稳定，因此会导致添加胆固醇的生长液的半衰期十分短暂。另外，当使用化学成分确定的无血清的细胞培养液而非含有胎牛血清的培养液培养胆固醇营养缺乏型细胞系时，胆固醇沉淀的情况更易发生。最终，胆固醇因为其内在的多聚体亲和性而不易滤过小孔无菌滤膜例如PES，从而导致在最终滤过的培养中胆固醇含量显著下降。这一现象导致添加胆固醇细胞培养液制备批次间的不一致性。当在细胞培养液内直接加入胆固醇而不经过过滤会产生引入污染的可能性例如异源物质或/及内毒素。

NS-0细胞产生胆固醇营养缺乏的分子机制最近已经被确证(European Collection of Cell Cultures-ECACC，No.85110503，Deposited by Dr J Jarvis，MRC Laboratory of Molecular Biology，Cambridge，73B(3)Methods in Enzymology(1981)。此细胞系不能表达胆固醇体内生物合成通路中一个关键的蛋白酶。这个称作3-酮固醇还原酶(3-KSR)的蛋白酶属于beta-羟基固醇脱氢酶家族的一个成员，是由一个特定基因所编码的。3-KSR能够催化酵母甾酮转变为酵母甾醇的化学反应，酵母甾醇是胆固醇的前体Marijanovic等人，17(9)MOL.ENDOCRINOL.1715-25(2003)。

就NS-0细胞的胆固醇营养缺乏问题，一系列不同的技术手段被提议，以改善制备细胞培养程序的效率以及减弱胆固醇在水性培养液中低溶解能力的局限性。其中的一个方法是使用植物来源或者合成的脂质代替动物来源的脂质加入细胞培养液Gorfien等人，16(5)BIOTECHNOL.PROG.682-7(2000)。另外的一个方法是改造NS-0细胞使之能够过量表达3-KSR从而逆转其在细胞内的不足从而使得细胞在未加入胆固醇的细胞培养液中正常生长Seth等人，121(2)J.BIOTECHNOL.241-52(2006)。最后，研究人员研究了NS-0细胞内3-KSR活性缺乏的分子机制，试图通过对关键上游调控区域去甲基化，消除其对3-KSR基因的转录抑制能力从而使3-KSR的水平恢复正常Seth等人，93(4)BIOTECHNOL.BIOENG.820-27(2006)。