[发明专利]丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术，制备一种丙型肝炎病毒基因型检测的试剂盒，用于快速准确地区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是重要的肝脏疾病致病因子。目前，全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报，在2001年，慢性肝病引起1,400万例死亡，包括79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发性肝癌引起。而在2001年，因慢性肝病引起死亡的病例中就有20％(超过2.8万)是由HCV感染引起。目前已经有大量病例可以证明在大多数国家由肝癌引起的死亡数量的增加是由于丙型肝炎感染造成。

丙型肝炎病毒是一种正性单链RNA黄病毒，包括9,400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，编码一具有3,010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达1.4-1.9×10^-3/核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-prone RDRP，EP-RDRP)的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为：病毒基因组中各种基因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，HCV至少可分为6型(HCV1—6型)，各型又分许多亚型(如1a、1b、2a、2b等)。各型核酸序列之间相差31—34％，氨基酸序列相差大约30％，而亚型序列之间相差约20—23％。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系统进化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。

目前对HCV基因分型方法主要有：限制性长度多态性(RFLP)，型特异性引物PCR，型特异性探针核酸杂交分析，直接测序等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，检测时间长，价格昂贵，灵敏度低，特异性不高等缺点，不适合广大基层医院开展。因此本发明人结合已知的PCR-斑点杂交方法，制备了一种短时间内检测丙型肝炎基因型的试剂盒。

发明内容

本发明涉及检测临床生物样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是提供了一种利用核酸反向斑点杂交技术快速准确的区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒。

因此本发明的一个目的是提供一种用于检测临床生物样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括(1)待检血清样品RNA的提取试剂(2)逆转录试剂；(3)聚合酶链式反应试剂；(4)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂。其特征在于：

丙型肝炎(HCV)病毒核酸(RNA)逆转录引物：

逆转录(RT)引物：5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′(SEQ ID NO:1)

聚合酶链反应扩增体系中使用的上游和下游引物分别为：

PCR上游引物：5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′(SEQ ID NO:2)

PCR下游引物：5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(SEQ ID NO:3)

杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：

探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO:4)

探针PC1：5′-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3′(SEQ ID NO:5)

探针PC2：5′-CGGAACCGGTGAGTACACC-3′(SEQ ID NO:6)

探针1：5′-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3′(SEQ ID NO:7)

探针1b-1：5′-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3′(SEQ ID NO:8)

探针1b-2：5′-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3′(SEQ ID NO:9)

探针2-1：5′-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3′(SEQ ID NO:10)

探针2-2：5′-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3′(SEQ ID NO:11)

探针2a-1：5′-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3′(SEQ ID NO:12)