[发明专利]布鲁氏菌分子标记和毒力缺失弱毒疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏菌弱毒疫苗及生产工艺，尤其是提供一种可区分自然感染或野毒感染的布鲁氏菌弱毒疫苗，用于能区分人与动物是疫苗接种还是自然感染；本发明还公开了上述疫苗的生产方法，属于免疫疫苗生产技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由小球杆状布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病，在世界各地都有广泛流行。每年因此造成的经济损失高达数十亿美元，而且此病还会对人类健康造成严重威胁。从上个世纪90年代起，人与动物发病率又有上升的趋势。

当前的布鲁氏菌疫苗种类较多。重组蛋白疫苗与DNA疫苗保护性能有限，灭活疫苗保护期短。目前人和动物多用弱毒疫苗，弱毒疫苗较前几种疫苗保护作用及效果好，但它同样存在着缺陷，致使人们不敢、不愿也不能对其广泛应用。主要原因是：其一，接种后人们无法区别自然感染和人工接种免疫。如果广泛应用这样的疫苗就给该病流行病学调查，探查疫源产生很大的障碍。许多国家与地区限制用血清学方法检测布鲁氏菌病呈阳性地区的肉制品、奶制品进口，对国际贸易产生严重的影响；其二，毒性大，返祖现象严重，会对人与动物机体造成伤害，甚至发病。所以研制一种能区分是自然感染还是人工主动免疫，保护性能好，毒力弱、安全性能好的布鲁氏菌病弱毒疫苗具有重要的实践意义。

所以构建一株能区分是自然感染还是人工接种免疫，保护性能好，毒力弱的布鲁氏菌弱毒疫苗是本发明的任务。

发明内容

本发明的目的是公开一种可区分自然感染或野毒感染的布鲁氏菌弱毒疫苗ΔS19-1和ΔS19-2，解决了常规的布鲁氏菌疫苗不能区分人与动物是人工免疫接种还是野生菌感染、病毒强，容易至使接种的人与动物不良反应、甚至发病的问题。

本发明还公开了该布鲁氏菌弱毒疫苗的制备方法，适用于工业化生产。

一种布鲁氏菌弱毒疫苗ΔS19-1，特征在于：布鲁氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成ΔS19-1。

一种布鲁氏菌弱毒疫苗ΔS19-2，特征在于：ΔS19-1毒力基因Bmp18缺失而成弱毒疫苗株ΔS19-2。

本发明的技术解决方案如下：

为了本发明的目的，首先以布鲁氏菌的弱毒疫苗株S19为起始材料，以PCR的方法从S19的染色体中扩增出要改造的目的基因Bp26的引导序列，并把它克隆到T载体上，进行基因改造。而后把这个经改造的引导序列克隆到pBK-CMV上而成重组质粒pBK-BP26-Luc，并在pBK-Bp26-Luc合适的位置上，克隆上sacB基因，最终成为同源重组载体(自杀性质粒)pBLs。用同样的方法得到布鲁氏菌毒力基因Bmp8的引导序列，克隆到T载体上，进行基因改造，并把它连接到pBluescriptSK⁺重组质粒，最终成为同源重组载体pBBs，

用电转化法把自杀性质粒pBLs转化到布鲁氏菌S19中，由于同源重组载体(自杀性质粒)不能在布鲁氏菌中自主复制，因此转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀质粒便会被线性化。因自杀质粒上含有受体菌基因的同源序列，它便会插入受菌体S19的染色体中，接着线性化的质粒与Bp26基因发生置换，也就是通常所说的单交换同源重组事件的发生。只有置换到S19染色体上被线性化的自杀质粒才能随着染色体的复制而存在。把受体菌涂布在含有筛选标记的肝汤琼脂平板上，因自杀质粒上带有筛选药品抗性基因，所以很容易的筛选出单交换子。由于单交换是整个载体序列(含筛选药物抗性基因和sacB基因)都置换到染色体上，因此，我们必须筛选仅有经改造的目的基因整合到染色体上的双交换子。将获得的同源重组单交换子液体培养物涂布于添加5％蔗糖的肝汤培养基平板上，挑取单菌落即为阳性同源重组双交换子。因为如果布鲁氏菌双交换子染色体上存在sacB基因等    载体序列，在蔗糖存在的情况下将会导致细菌死亡，只有在5％蔗糖肝汤培养基上生长的菌落才是发生2次重组的双交换子(丢失sacB基因和抗性等载体序列)，即得到本发明的ΔS19-1。

用同样的方法把自杀性质粒pBBs转化到ΔS19-1中去得到本发明的ΔS19-2。

用这样的方法首先得到布鲁氏菌弱毒疫苗株S19的Bp26基因突变缺失株ΔS19-1，而后得到ΔS19-1毒力基因Bmp18缺失株ΔS192。

本发明的具体制备方法主要包括以下步骤：

(1)以布鲁氏菌弱毒疫苗基因组为模板，设计引物，用PCR的方法，扩增出分子标记目标基因的同源重组引导序列，而后克隆到T载体上对目标基因改造；