[发明专利]一种高效生产腺病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药工艺领域、特别是涉及一种生产重组腺病毒的方法。

背景技术

随着2004年世界上第一个基因治疗产品今又生的上市，基因治疗越来越得到人们的认可。腺病毒是基因治疗中常用的基因病毒载体，它的优点在于转染效率高、可操作性好、能携带较大的目的基因片段、可制备高效价的病毒颗粒，易于工业化生产，既能感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，具有安全、致病性低等优点。故生产出符合临床用药要求的高质量而且大量的腺病毒就非常重要。

传统上大量生产腺病毒的方法是组织培养瓶或“细胞工厂”方式生长。收获病毒感染的细胞并使之冻融，以细胞粗制裂解液的形式从细胞中释放出病毒。该传统方法不能生产大量所需的病毒。

2004年上市的今又生和张树元采用的方法相似，均是采用cellcube系统(灌流细胞培养系统)。即病毒感染宿主细胞后，通过收集并裂解细胞的方法收获病毒。

美国专利6,485,958公布了收集病毒上清及对所收获上清的纯化方法。具体为1、生产重组腺病毒的方法，这个方法包括将腺病毒DNA导入包裹细胞，收获上清。2、至少50％的腺病毒释放到上清中。3、至少70％的腺病毒释放到上清中。4、至少90％的腺病毒释放到上清中，等等。实施例中分别列举了收获病毒上清和收获细胞的方法。实施例3为病毒感染后40-72小时收获细胞，通过3-6次反复冻融裂解细胞。实施例4为感染后培养8-12天收集病毒上清。

美国专利6,905,862采用了收获病毒培养上清和收集细胞并破碎这两种方法。但是没有对收获病毒上清的培养方法进行具体说明。该专利保护的是：1：从生物培养基中纯化腺病毒的方法步骤，包括：得到含腺病毒的生物培养基；离子交换；得率至少为病毒颗粒的70％；2：1中的腺病毒为重组腺病毒；3：2中的生物培养基为生产腺病毒的细胞的上清；4：2中的生物培养基为生产腺病毒的细胞的裂解物；等等。

上述方法均没有对具体的培养方法进行说明。同时通过收集细胞并破碎的悬浮方法来生产腺病毒有以下缺点：细胞破碎时容易产生浮质，对能在空气中传播的病毒，容易污染；细胞破碎时容易使介质中存在大量细胞碎片，使纯化更加复杂。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种可大规模生产腺病毒的生产方法。该方法包括：

a)接种宿主细胞，使细胞在培养基中生长；

接种宿主细胞于生物反应器中，接种密度为1-5×10⁵个细胞/ml，进行灌流培养。

b)置换生物反应器罐体内的培养液，用腺病毒感染所述宿主细胞，病毒繁殖；

当生物反应器内的细胞量达到5×10⁶-3×10⁷个/ml时，用病毒培养液置换生物反应器内的细胞培养液，然后接种病毒，并使病毒在生物反应器内进行繁殖。当葡萄糖浓度下降至1.0-1.5g/l时开始灌流，维持生物反应器罐体内葡萄糖浓度为0.1-1.6g/l。

c)收集病毒悬液。

通过监测生物反应器内培养液中病毒浓度，当病毒浓度达到1×10¹⁰vp/ml时收集病毒悬液。

d)浓缩病毒上清。

将收获的病毒上清进行超滤浓缩。

还包括用层析将腺病毒从所述浓缩液中分离出来。

腺病毒生产过程中所用的培养基，接种密度，细胞感染密度，病毒感染复数(MOI)，载体类型和感染时间都影响腺病毒的产量。为实现上述目的，本发明的细胞培养液为DMEM+2-10％的血清，血清浓度优选为5-10％。病毒培养液为DMEM+0.01-2％的血清。

为实现上述目的，本发明的病毒感染宿主细胞的MOI为5-50，优选为5-25。

为实现上述目的，本发明中当生物反应器内的细胞量达到5×10⁶-3×10⁷个/ml时感染病毒。

根据上述方案，本发明的宿主细胞是能包装重组腺病毒的细胞，优选为HEK293、A594、PER.C6细胞等。更优选的HEK293细胞是人胚肾细胞，整合了Ad5左端12％的基因组，含有Ad5E1区。

本发明的腺病毒可以是人腺病毒，优选为Ad5，Ad2，Ad6，Ad35。也可以是动物腺病毒。本发明的腺病毒是包含编码外源基因的重组腺病毒。包括用于基因治疗的重组腺病毒和用于疫苗的腺病毒载体。

本发明采用当病毒浓度达到1×10¹⁰vp/ml时收集病毒。