[发明专利]产甘油假丝酵母NAD+依赖－甘油3－磷酸脱氢酶基因及其克隆

权利要求书

1.一种产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59中分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的多核苷酸的2082bp-3249bp核苷酸序列，编码基因产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的一种分离的多核苷酸SEQ ID NO.1，其特征是其2082bp-3249bp核苷酸序列，经过一个或多个碱基的取代、缺失、置换、倒位或添加的有义突变。

4.根据权利要求1所述的一种分离的多核苷酸SEQ ID NO.1，其特征是所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中自起始密码子ATG上游向前的1-2081bp核苷酸序列。

5.如权利要求2所述产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因的克隆，其特征是：

(1)简并引物PCR扩增产甘油假丝酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因片段：

以GeneBank公布的其他物种的甘油3-磷酸脱氢酶的基因序列为基础，通过序列比对分析，设计简并引物

CD-U：5′-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3′，

CD-R：5′-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3′；

通过PCR技术，以WL2002-5-59基因组DNA为模板，以CD-U，CD-R为引物扩增获得0.63kb的核苷酸片段，经过TA克隆，测序；

(2)反向引物PCR扩增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列：

根据简并引物PCR获得的DNA序列结果，设计一对反向引物

CgI-F：5′-CCTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3′，

CgI-R：5′-CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3′；

提取WL2002-5-59基因组DNA，分别用BamH I、Pst I、Sal I酶切后用酚、氯仿纯化，再用T₄DNA连接酶进行自身连接环化，用乙醇沉淀后作模板进行PCR扩增分别获得6.7kb、2.5kb、2.3kb的DNA片段，经TA克隆挑选阳性转化子，序列测定拼接后获得全长的产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶编码基因及其侧翼调控序列。