[发明专利]一种产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法

权利要求书

1.一种产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，包含有培养斜面孢子、菌株诱变、筛选的方法，其特征是以人工诱变的真核细胞菌和经筛选具有一定优势性状的野生型真核细胞菌为出发菌株，经过原生体制备和原生体融合为主的基因组改组、递推式多次融合，获得具有较好性状优势的菌株。

2.根据权利要求1所述的产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，其特征是所述的基因组改组中原生质体的制备时：

1)将优良菌株和野生型菌株，分别在25～26℃的温度下培养2-3d后，选取产孢子丰满的菌种加水制备悬浮孢子；

2)将以上孢子悬液涂布于培养皿中，于25～26℃培养19～20h；将以上孢子悬液涂布于培养基上，优良菌株于25～26℃培养19～20h，野生型菌株于35-36℃培养15～16h；

3)将幼龄菌丝置于盛有4mL/皿DTT溶液的培养皿中，室温预处理0.5h，离心。

4)将菌丝转移到盛有复合酶液的量培养皿中，处理3～3.5h；

5)过滤原生质体和孢子混合液，离心，弃上清液，用高渗溶液洗涤并再离心3次；

6)将诱变多代后获得的优良菌株和野生型菌株，在25～26℃的温度下培养2-3d后，选取产孢子丰满的菌种斜面，加水制备悬浮孢子，孢子量在5×10⁷/mL以上。

3.根据权利要求1所述的产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，其特征是原生质体融合时：

1)将高渗溶液加入到制备好的原生质体沉淀中，吹匀；

2)取6株原生质体集中到一个皿内，进行融合，融合10min，以高渗溶液稀释；

3)取一定的稀释液分离到事先制备好的双层高渗再生培养基上.于30℃培养60～70h，菌落上长出一定量孢子，供初筛。

4.根据权利要求1所述的脂肪酶原生质体多亲本融合的方法，其特征是所述的DTT溶液是用高渗溶液进行配制，终浓度为0.01mol/L。

5.根据权利要求1所述的产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，其特征是所述的递推式多次融合是指在第一次基因组改组、筛选的基础上的再次改组与筛选。