[发明专利]一种产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物育种方法，具体说涉及建立一种基于基因组改组技术进行原生质体多亲本融合的方法。

背景技术：

近年来，脂肪酶(lipase EC 3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪作用等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已成为世界酶制剂市场上重要的品种。但是与其它的水解酶，如蛋白酶和淀粉酶相比，碱性脂肪酶出发菌在工业应用中还存在着酶热稳定性较差的问题，影响了生产收率、产品的运输、以及进一步应用和开发。因此选育出具有良好的热稳定性的碱性脂肪酶产生菌株是国际上研究热点。

2002年，美国加州Maxgen公司的Cardayré等人提出了Genome Shuffling技术(国内翻译成“基因组改组”)的概念，它把传统微生物诱变育种技术与细胞融合技术结合，在微生物菌株诱变的基础上，通过细胞融合，使多个亲本杂交，产生新的复合子代。其具体操作过程是通过对出发菌株进行诱变，然后在模拟DNA重组的条件下对原生质体进行多亲本递推式多次融合(recursive protoplast)，最后筛选出具有多重正向进化标记的目标菌株。此技术的育种效果十分显著，已有成功应用的报道。Cardayré等人成功地运用Genome Shuffling技术，在短时间内实现了快速提高泰乐菌素产生菌(Soreptomyces fradiae)的产量的目标。Cardayré等人仅花费一年时间就取得了相当于他人此前20年工作的成果；RanjanPatnaik等应用基因组改组技术对一株乳酸杆菌的耐酸性进行改造，同样获得了成功；MingHua Dai等应用基因组改组技术改良了Sphingobium chlorophenolicumATCC 39723，大大提高了降解杀虫剂中五氯苯酚的性能。上述工作，基本上集中于原核微生物，在相关文献检索中尚未发现运用基因组改组技术改善真核微生物代谢产物的性能，如酶的热稳定性等。

2007年，施碧红等首次将基因组改组技术用于研究真核微生物育种，取得提高扩展青霉碱性脂肪酶产量的初步效果，改组得到的扩展青霉碱性脂肪酶与原出发菌株相比产量有较大的提高。

发明内容：

本发明的目的是以真核微生物为出发菌株，通过建立一种原生质体多亲本融合方法，达到改善真核微生物代谢产物的性能，对扩展青霉碱性脂肪酶进行改造，提高其产物碱性脂肪酶的热稳定性。

为实现本发明的目的采用的技术方案是：以人工诱变的真核细胞菌和经筛选具有一定优势性状的野生型真核细胞菌为出发菌株，采用细胞原生质体多亲本融合方法，经培养斜面孢子、菌株诱变、基因组改组、筛选、递推式多次融合，获得具有较好性状优势的菌株。具体通过以下步骤实现：

第一步：培养诱变用斜面孢子

将菌株接种于斜面培养基中，一段时间后，选取产孢子丰满的菌种斜面，加水制备悬浮孢子，孢子量在5×10⁷/mL以上。

第二步：菌株诱变

取5mL孢子悬液转移至培养皿中，于15W紫外线灯下照射20～35s。再从中取2mL移至避光的试管中，加入终浓度为100μg/mL的NTG，于25～28℃水浴中保温30min后，加入100mL无菌水中止诱变。将孢子悬液涂布于琼脂发酵培养基平板上，25℃培养约45～70h，肉眼可见微小的菌落。用打孔器将菌落和培养基一同取出(即琼脂块)，排列在灭菌培养皿中，培养至菌落占据琼脂块后，将琼脂块移至橄榄油乳化液鉴定板上，28℃保温1-3d，观察透明圈大小，选取透明圈较大的5株菌，接种至斜面培养，进一步摇瓶培养，测定酶活。

第三步：基因组改组

原生质体的制备

将诱变后获得的5株优良菌株和1株野生型菌株，接种于斜面培养基，在25～26℃的温度下培养2-3d后，选取产孢子丰满的菌种斜面，加水制备悬浮孢子，孢子量在5×10⁷/mL以上。

在9cm培养皿中倒入菌丝生长培养基，冷却后覆盖灭菌玻璃纸，将以上孢子悬液涂布其上.诱变多代后获得的优良菌株于25～26℃培养19～20h，野生型菌株于35-36℃培养15～16h。

用镊子将附有幼龄菌丝的玻璃纸揭下，反置于(将菌丝刮下也可)盛有DTT溶液的培养皿中(4mL/皿)室温预处理半小时(DTT溶液以高渗溶液配制，终浓度为0.01mol/L。DTT购自上海丽珠东风生物工程有限公司)，离心。