[发明专利]一种改良BCA－紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法。

背景技术

氨苄青霉素(别名：氨苄西林、氨苄青、安比西林、沙维西林、赛米西林、氨苄西、潘别丁)。英文名：ampicillin，是β-内酰胺类抗生素中青霉素类的一种，其核心基团为闭合噻唑环、β-内酰胺环。氨苄青霉素的分子式为C₁₆H₁₉N₃₀₄S₁，分子量为349.41，是目前较常用的广谱半合成青霉素，毒性低，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有作用，具有较强的杀菌作用。被广泛应用于动物的各种疾病的治疗和饲料添加剂中，因而造成食物中的残留。长期饮用含有青霉素类抗生素残留的牛奶会使人体产生耐药性和过敏反应等，对人体造成危害。因此，各国都对牛奶中各种抗生素的最大残留(MRL)作出了限量标准。

目前国内检测青霉素类抗生素残留最简单、快速、灵敏的方法是免疫分析方法。免疫分析方法的核心试剂是全抗原和检测用抗体，而制备高质量抗体的前提是有高免疫原性的全抗原。氨苄青霉素是小分子物质，属于半抗原，不具有免疫原性，需要将其与蛋白质载体偶联制成人工抗原才能刺激动物体产生抗体。氨苄青霉素人工抗原偶联率的高低直接反应其免疫原性的强弱，决定其抗体的质量。有研究表明在5～30之间，偶联率越高，其免疫原性越强。

对人工抗原的偶联率的测定一般采用的方法是紫外分光光度法，其原理是根据半抗原的特征吸收峰，通过分别测定半抗原和载体蛋白的吸光度，通过与各自的标准曲线的判定浓度，得出的浓度比。本试验通过在280nm和254nm(中华人民共和国药典HPLC检测波长)下分别测定BSA和AMP的浓度，当起始摩尔比为20∶1时，按照此方法算出的偶联率为67.82∶1，这与实际不符。我们通过扫描氨苄青霉素标准品，发现它在紫外下从250～270nm均有吸收，但是没有特征吸收峰，因此不能采用一般紫外方法来测定。也有报道采用SDS-PAGE电泳通过分子量来计算偶联率的大小，但载体蛋白和氨苄青霉素的分子量相差200多倍数量级，测定难度较大，操作技术复杂，准确性比较差。因此，尚未有一种相对准确的测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法报道。

BCA(bicinchoninic acid二喹啉甲酸)法是一种测定微量蛋白质的方法，其原理是基于蛋白质中的游离氨基将该试剂中的Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度，是一种常用的测定微量蛋白质的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法。

本发明采用如下技术方案：通过紫外的方法测定人工抗原中牛血清白蛋白的浓度；根据氨苄青霉素和牛血清白蛋白分子结构中均具有还原性的氨基，都能与BCA试剂反应显色，而且氨苄青霉素在偶联的过程中开环，偶联之后其还原能力基本保持不变；将人工抗原与BCA试剂反应，测定总的吸光度，根据吸光度的加合性原理，减去此浓度的牛血清白蛋白在BCA试剂下的吸光度，间接得出人工抗原中氨苄青霉素的浓度；计算氨苄青霉素和牛血清白蛋白的分子数之比即为偶联率，偶联率＝C_AMP/C_BSA。

  本发明的操作步聚是：(1)分别制定一系列浓度的标准曲线：标曲①为BSA 280nm；标曲②为BSA-BCA562nm；标曲③为AMP-BCA 562nm；(2)测定氨苄青霉素人工抗原在280nm，562nm下的吸光度A_BSA280，A_总562，由A_BSA280经标曲①得出人工抗原中BSA的浓度C_BSA，再由C_BSA经标曲②判定C_BSA浓度BSA在562nm下的吸光度A_BSA562；(3)人工抗原偶联物中AMP在562nm下的吸光度为A_AMP562＝A_总562-A_BSA562，再由标曲③判定AMP的浓度C_AMP；(4)偶联率＝C_AMP/C_BSA。

本发明的氨苄青霉素人工抗原偶联物是通过物理法制备，即将BSA和AMP加入到碱性的缓冲液中，在37℃，24小时的条件下直接偶联合成。