[发明专利]用于生产L-天门冬酰胺酶Ⅱ的重组宿主

说明书

本申请要求2006年6月30日提交的临时美国专利申请60/817,817的权益，其内容在此全文引入作为参考。 

发明领域

本发明涉及生产具有均一纯度的特异性重组大肠杆菌(E.coli)L-天门冬酰胺酶II的新载体、宿主细胞和方法。 

相关领域描述 

L-天门冬酰胺酶是一种将氨基酸L-天冬酰胺水解为L-天冬氨酸和氨的酶，即，其是一种脱氨基酶。大肠杆菌含有天门冬酰胺酶的两种同工酶：L-天门冬酰胺酶I和L-天门冬酰胺酶II。L-天门冬酰胺酶I位于胞质溶胶中，对天冬酰胺的亲和性低。L-天门冬酰胺酶II位于周质，对L-天冬酰胺具有高亲和性。 

L-天门冬酰胺酶II可通过去除细胞外的天冬酰胺，用于治疗依赖L-天冬酰胺进行蛋白合成的肿瘤或癌症。其在治疗白血病，例如急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)中特别有效。L-天门冬酰胺酶通常与其它抗肿瘤或抗癌治疗联合使用，尽管在某些临床情形下其可以单独使用。L-天门冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌(E.coli)和软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。在哺乳动物中，仅在豚鼠(Cavioidea超科)和某些阔鼻猴(New World monkey)中发现略高于痕量的L-天门冬酰胺酶II。 

大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II为相同亚单位的四聚体，具有良好的k_cat和K_m。大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II(本领域也称做L-天冬酰胺酰胺水解酶，EC-2型、EC 3.5.1.1)可以商品名(Merck & Co.，Inc.)从商业上获得，也可从Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd获得。 

L-天门冬酰胺酶II本身具有蛋白质疗法的通常不利因素，例如患者对外源蛋白的高清除率，以及在用该酶治疗的患者体内可能诱导免疫应答。为了克服这些缺点，已经开发了与聚乙二醇偶联的L-天门冬酰胺酶II衍生 物，由Enzon Pharmaceuticals，Inc.以商品名pegaspargase或推向市场。Pegaspargase使用Merck提供的、从大肠杆菌提取的L-天门冬酰胺酶II制备。Pegaspargase(也称单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基L-天门冬酰胺酶)具有基本上非抗原性、从循环中的清除速率下降的优点。 

然而，尽管获得了这些成功，如果大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II蛋白能够由重组宿主细胞使用合适的染色体外表达载体(例如质粒)生产，将会更加有效和经济。这类表达载体可以被工程化，以使得蛋白的生产比天然大肠杆菌菌株更有效率。虽然这种重组制备具有可能的优点，据信迄今为止并没有商用L-天门冬酰胺酶II的准确公开的多肽序列，也没有公开编码该酶的多核苷酸序列。例如，先前Maita等人，1980，Hoppe Seyler′s Z.Physiol.Chem.361(2)，105-117，以及Maita等人，1974，J.Biochem.76，1351-1354[Tokyo].报道了L-天门冬酰胺酶II肽序列，然而，如下文中讨论的那样，该早期工作有大量测序错误。 

L-天门冬酰胺酶II亚单位质粒表达的另一个可能障碍是存在编码L-天门冬酰胺酶II亚单位的基因，该基因对于可能用作宿主细胞的大肠杆菌菌株染色体而言是天然的。这样，就担心从携带染色体外表达载体的E.coli宿主细胞中收集的L-天门冬酰胺酶II可能包括代表L-天门冬酰胺酶不止一种同工型的亚单位。由于为了临床和管理目的需要获得明确表征的酶产品，这一可能性迄今为止代表了在改善大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II蛋白生产效率方面严肃的技术挑战。 

发明概述 

本发明满足了上述对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II的需求，该酶以重组体形式高效和经济地生产，而提供与商品名为的大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II蛋白具有同样的多肽结构的酶产品，同时该酶产品不含可检测量的L-天门冬酰胺酶II其它同工型。 

因此，本发明提供了大肠杆菌宿主细胞，其包含大肠杆菌染色体和至少一份拷贝的重组染色体外载体，其中染色体外载体编码L-天门冬酰胺酶II蛋白的亚单位，大肠杆菌宿主细胞染色体编码L-天门冬酰胺酶II蛋白的相同亚单位，其中大肠杆菌宿主染色体不编码L-天门冬酰胺酶II任何其它的同工型。所述染色体外载体优选为适于在大肠杆菌中复制并表达的质粒。