[发明专利]纯化流感病毒的方法

说明书

本发明涉及纯化流感病毒或其衍生物的方法、生产流感病毒或其衍生 物的方法、流感病毒或其衍生物的级分、包含流感病毒或其衍生物的疫苗 及载体。

技术领域

本发明涉及对不同量的流感病毒或其衍生物的纯化。特别地，本发明 提供了一种快速有效并可放大的用于纯化可用于人类(例如预防性应用， 如疫苗接种)的商业量流感病毒的方法。

发明背景

流感病毒属于正粘病毒科，并根据抗原性差异分为甲型、乙型和丙型。 甲型和乙型流感病毒是重要的呼吸系统病原体，而甲型流感病毒是造成高 致死率流行病的主要原因。

流感病毒具有分段的、单链的负链RNA基因组。甲型流感病毒的基 因组由编码11种(有些甲型流感病毒株为10种)蛋白质的8个RNA分 子组成。病毒包膜由位于基质蛋白(M1)层上的脂双层构成。糖蛋白血凝 素(HA)和神经氨酸酶(NA)包埋在脂双层中，它们分别负责病毒附着 并侵入细胞以及从受感染细胞中释放出子代病毒。这两种蛋白质还决定了 甲型流感病毒的亚型。由于分段的基因组所致的高突变率和频繁基因重排 导致了甲型流感病毒的强免疫学变异性，特别是HA和NA抗原。乙型病 毒不呈现出相同程度的抗原变异性并且主要是儿童病原体，其偶尔可以造 成像甲型病毒同样严重的流行病。

流感的潜伏时间为1到5天。临床发病特征为突然发烧、头疼、不适 和肌肉疼痛。全身症状通常持续3天。尽管没有所有国家的流感相关死亡 的准确数据，但在美国，在年龄大于65岁的人群中与流感相关的死亡为每 100000人中30到150人。

在流感流行时，1％-5％的发病率是非常常见的，但是发病率也可以达 到40％-50％。因此，流感流行或甚至大流行在经济上的影响可以是巨大 的。疫苗接种被认为是限制流行及其有害影响的最佳方法。

自从1940年代引入以来，已经发现基于培养于鸡蛋中病毒材料的疫苗 能明显有效地抵抗流感的感染并显著降低高危人群中的死亡率。早期的疫 苗被鸡蛋来源的成分高度污染，并且高致热且缺乏效力。为了克服这些问 题，尝试了许多不同的纯化流感病毒的纯化技术和方法。Veerarghavan和 Sreevalsan(1961)比较了几种不同的浓缩和纯化流感病毒的方法，并发 现两轮磷酸铝处理是最好的方法，然后超速离心、红细胞吸附、单轮磷酸 铝处理，最后是氧化锌方法。1960年代，报道了在磷酸钙和琼脂糖凝胶柱 上对流感病毒进行小规模色谱纯化的早期尝试(Pepper，1967)，但在实验中 没有测定病毒的感染性。Wallis等(1972)表明了在低于6.0的低pH条 件下流感病毒可以吸附到不溶性聚电解质上，随后在高pH值条件下被洗 脱。因为病毒对pH值敏感以及没有测定纯化后病毒的感染性，该方法纯 化感染性流感病毒的适用性是未知的。也尝试了用聚乙二醇沉淀随后通过 受控孔径玻璃珠进行凝胶渗透色谱对流感病毒进行纯化并与密度梯度方 法进行比较(Heyward等，1977)。密度梯度方法所需的时间是沉淀和凝胶 渗透色谱之组合的10倍，而两种方法获得的病毒纯度是相似的。Sagar等 (1980)使用带正电的“Zeta Plus”过滤器对流感病毒进行浓缩，但如作者 所建议的，仍需要进一步的纯化步骤。

US-A-3632745描述了通过对含二价金属阳离子(例如镁)的水溶液透 析病毒悬液来纯化流感病毒。US-A-3485718和3547779都公开了将硫酸钡 用于纯化流感病毒。US-A-3478145公开了磷酸钙在纯化流感病毒中的用 途。US-A-3874999描述了由不同的离心步骤、沉淀(用MgSO₄)、超滤和 透析组成的方法。EP-A-0171086公开了通过使用纤维素硫酸酯或交联多糖 硫酸酯的柱色谱纯化流感病毒的方法。所述专利申请仅仅公开了解决从尿 囊液中纯化流感病毒，并且没有根据仍然未知的病毒感染性来确定病毒的 回收率。在病毒吸附到色谱柱以及清洁步骤之后，用影响病毒感染性并降 低感染性病毒回收率的含有高NaCl浓度(1.49M)的缓冲液从所述柱上 洗脱病毒。所述方法基于对病毒颗粒具有低动态结合能力的颗粒载体，而 另外所述动态结合能力还强烈地依赖于流速。这些性质显著影响下游方 法，由于需要大的柱尺寸并只能使用低流速，所有这些都导致所述方法相 当低的产率。