[发明专利]在生物介质中测定酶活性的方法

权利要求书

1.在凝固的血浆中测定即时的凝血酶过程的方法，其包括下列步 骤：

a)将信号底物加入到含有预定量凝血酶活性的反应混合物中，所 述信号底物在与所述凝血酶活性反应后，产生与所形成的转化产物相 关的可检测信号；

b)通过数学方法确定步骤a)中的即时信号曲线的特征，以便计 算曲线的起始斜率，并对其曲率进行估算；

c)在其中出现凝血酶生成的血浆中加入信号底物，所述信号底物 在与凝血酶反应后产生与所形成的转化产物相关的可检测信号；

d)向同样的样品或其中出现凝血酶生成的相同血浆的另一个样 品中加入荧光化合物，提供可检测的信号，以供用作血浆引起的浊度 和/或颜色对信号的影响的度量；

e)将步骤d)中的测量结果与步骤a)中的测量结果进行比较，以建 立一种相关性来校正其中出现凝血酶生成的血浆的浊度和颜色；以及

f)使用在步骤b)中测定的1)的测量结果的曲率，来校正在其中测 量信号的系统的非线性，并使用从步骤b)得到的起始斜率，从步骤c) 中测量的信号来计算即时的凝血酶浓度。

2.在第一个生物学样品中实时测定蛋白水解活性从样品中出现并 消失的过程的方法，所述蛋白水解活性主要是凝血酶活性，所述方法 包括下面的步骤：

a)在所述第一个样品中加入蛋白酶激活剂以生成蛋白水解活性；

b)在步骤a)中加入信号底物，所述信号底物在被生成的蛋白水解 活性反应后，产生与形成的转化产物的量相关的可检测信号；

c)在适当的介质例如缓冲液中加入对步骤b)中定义的信号底物具 有已知的稳定的蛋白水解活性的工具，其中所述具有熟知的稳定的蛋 白水解活性的工具选自α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物、葡萄球菌凝固酶- 凝血酶原复合物、γ-凝血酶和凝血酶；

d)在步骤c)中加入与步骤b)中的定义相同的信号底物，所述信号 底物在被具有已知的稳定的蛋白水解活性的工具反应后，产生可检测 的信号；

e)使用b)中测量的信号源，以便该信号经过所述第一个样品，使 得信号的量受到所述第一个样品的颜色或浊度的影响；

f)在c)中测量到的信号量与e)中测量到的信号量之间建立起相关 性；

g)使用f)中的所述相关性计算c)中的即时信号的发展，以预测如 果在所述第一个样品中测量信号，该信号将会如何；

h)将g)中预测的曲线与b)中测量的曲线进行比较，以推导出在第 一个样品中即时蛋白水解活性的过程。

3.执行权利要求1或权利要求2的方法的试剂盒，其包括下面的 成分：

-已知浓度的被测量的酶或与被测量的酶对信号底物的酶活性类 似的化合物；

-启动酶生成的触发试剂；

-促进测试的诊断值的添加物；

-能够用于标准化和/或对照的血浆；

-试剂，其含有信号底物或添加有生成信号的离去基团的信号底 物；

-可直接加载到计算机内存中的软件程序，当所述程序在计算机 中运行时，用于计算通过本文公开的方法测定的酶活性；

-指导手册；

-校正量的荧光团，以供在出现酶生成的介质的内部或外部使用；

-荧光源，在出现酶生成的介质的内部或外部使用。

4.权利要求3的试剂盒，其含有冷冻干燥的试剂。