[发明专利]在生物介质中测定酶活性的方法

说明书

发明领域

本发明属于诊断学领域，并具体涉及在血液和其它流体中测定蛋 白水解酶例如凝血酶的生物学活性形式的新方法，以及执行该方法的 测试试剂盒。

发明背景

生物化学、化学、医学、诊断学等领域的许多实验室都对测定生 物介质中产生的酶感兴趣。为此，通常使用释放发色团或荧光团的信 号底物，因此在转化后将产生可以即时(in time)跟踪和测量的产色或 荧光信号。

在生物介质中即时跟踪酶的形成的方便方法是将底物直接加入到 生物介质中，例如将荧光底物加入到其中形成了凝血酶的凝固血浆中。 其优点是酶的生成在其生理介质中被测定。

该方法的缺点是，酶对于任何也可存在于该介质中的生理底物的 活性将与加入的信号底物发生竞争，并且在酶的生成完成之前，底物 可能完全消耗了。为了最小化这些影响，通常选择那些与酶的结合不 是太紧密(即K_M低)并且转化不是太快(即k_cat低)的底物。

另一个问题是被测量的信号通常依赖于发生反应的介质的浊度和 颜色。因此，来自不同来源或供体的介质中同样的酶量可能产生不同 的信号量。此外，发色团或荧光团的浓度可能不与信号的量直接成比 例。这使得在反应的时程期间计算存在的酶的量更加困难。为了即时 精确定量酶浓度，所有这些影响都必须纳入考虑。

WO 03/093831公开了在血液或血浆样品中实时测定样品中的蛋 白水解活性、特别是凝血酶活性在样品出现并消失的过程的方法，该 方法包括在样品中加入凝血酶底物，在每单位时间产生可检测的信号， 信号的量与凝血酶的存在量具有相关性。同时，在没有触发凝血酶生 成的同样血液或血浆的对照样品中，测定了具有恒定凝血酶活性的标 准制备物的活性。通过将在凝固的血液中测量到的活性与同时测量的 校正物获得的校正曲线进行比较，获得了在任何时候存在的凝血酶的 准确摩尔量。该专利还公开了如果介质的颜色对信号有影响，那么该 校正曲线最好在使用的每种颜色的介质中测定。

在不同颜色或浊度的另一种介质中测量同样量的校正的酶的方法 将产生非常相似的校正曲线，除了所谓的介质依赖性效应之外。

本发明提供了可选的方法，其中该校正曲线在一种介质中仅测量 一次，在不同颜色或浊度的相似介质中的测定不再通过测量全部曲线 来进行，而是可以用“单点”测定来代替。

发明简述

根据本发明，提供了在凝固的血浆中测定即时的凝血酶过程的方 法，包括下列步骤：

a)将信号底物加入到含有预定量凝血酶活性的反应混合物中，所 述信号底物在与所述凝血酶活性反应后，产生了与形成的转化产物相 关的可检测信号；

b)通过数学方法确定步骤a)中的即时信号曲线特征，以便计算 曲线的起始斜率，并对其曲率进行估算；

c)在其中出现凝血酶生成的血浆中加入信号底物，所述信号底物 在与凝血酶反应后产生与形成的转化产物相关的可检测信号；

d)向同样的样品或与其中出现凝血酶生成的相同血浆的另一个 样品中加入荧光化合物，提供了可检测的信号，用作血浆引起的浊度 和/或颜色对信号的影响的度量；

e)将步骤d)中的测量结果与步骤a)中的测量结果进行比较，以建 立一种关系，用于校正其中出现凝血酶生成的血浆的浊度和颜色；以 及

f)使用在步骤b)中测定的1)的测量结果曲率来校正测量信号的系 统的非线性，并使用从步骤b)得到的起始斜率从步骤c)中测量的信号 来计算即时的凝血酶的浓度。

本发明还提供了用于执行权利要求1的方法的试剂盒，其包括下 面的成分：

-已知浓度的被测酶或与被测酶对信号底物的酶活性类似的化合 物。

-启动酶生成的触发试剂。

-促进测试的诊断值的添加物。

-能够用于标准化和/或对照的血浆。

-试剂，含有信号底物或待添加产生信号的离去基团的信号底物。

-可直接加载到计算机的内存中的软件程序，当所述程序在计算机 中运行时，用于计算通过本文公开的方法测定的酶活性。

-指导手册。

-校正量的荧光团，其在其中出现酶生成的介质的内部或外部使 用。

-荧光源，其可以在其中出现酶生成的介质的内部或外部使用。

第一个生物学样品通常选自血液、血浆包括富血小板、贫血小板 或无血小板的血浆、唾液、血清、尿液、脑脊液、精液和粪便。