[发明专利]经修饰的猪α－干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种经修饰的猪α-干扰素基因，其特征在于对猪α-干扰素基因的核苷酸序列中6个关键密码子进行了修饰，所述6个关键密码子为Leu的密码子TTG，Pro的密码子CCA，Gln的密码子CAA，Ser的密码子TCC，Ala的密码子GCT和Arg的密码子AGA；修饰后的猪α-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2.一种权利要求1所述经修饰的猪α-干扰素基因所编码的蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据猪α-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成猪α-干扰素基因；所述引物序列如下：

上游引物P1：5′-GCG AAT TCC TGT GAC CTG TCT C-3′；

下游引物P2：5′-CCC TCT AGA TCA CTC CTT CTT CC-3′；

上游引物P1在其3’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，下游引物P2在其5’端加入了Xba I限制性内切酶位点和终止密码子TGA；所述EcoR I酶切位点GAATTC后补加了一个碱基C；

猪α-干扰素基因测序正确后，再对至关重要的6种氨基酸密码子进行改造，改造的位点主要是：Leu的密码子是TTG，Pro的密码子是CCA，Gln的密码子是CAA，Ser的密码子TCC，Ala的密码子是GCT，精氨酸(Arg)的密码子AGA；

(2)将经修饰的猪α-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZαC中，用Zeocin+YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验；

(3)收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；

(4)测定蛋白的含量及活性。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)包括以下步骤：

(a)用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28～30℃，200转/min振荡过夜，至OD600＝2～6，细胞处于对数生长期；

(b)将步骤(a)获得的细胞在3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5ml的BMMY培养基中，控制溶氧量和防止污染，在15ml的试管中继续振荡培养，所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY及采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5～20％；

(c)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，加入量为每毫升BMMY培养基加20微升，进行诱导培养。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，所述镜检是直接涂片镜检或用复红染色镜检。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述收获蛋白为培养96～120h后室温下1500～3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于-70℃保存；步骤(3)所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。