[发明专利]利用生物技术生产大豆异黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农业技术领域的方法，具体涉及一种利用生物技术生产大豆异黄酮的方法。

背景技术

大豆异黄酮(soybean isoflavones)是大豆在生长过程中形成的次级代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。目前发现的大豆中天然存在的大豆异黄酮为多酚类化合物，主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少，80％-90％的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1％-0.3％。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1％-2％，但由于胚只占种子总重量的2％，因此尽管浓度很高，所占比例却很少(10％-20％)。

大豆异黄酮是大豆中一类非常重要的非营养成分，它具有抗氧化、抗癌、提高免疫力、防止骨质疏松、类似雌性激素的作用。目前国内外主要采用直接从大豆中提取异黄酮、从大豆加工后的中间产物、废弃物中提取异黄酮，以及用分解与合成的方法生产大豆异黄酮。目前大多数的研究专利是直接从大豆粉、豆粕中提取大豆异黄酮。由于大豆的子叶及胚轴的异黄酮含量较高，尤其是萌发大豆的胚轴中大豆异黄酮含量很高。

经对现有技术的文献检索发现，中国专利申请号02114991.7，发明名称为萃取大豆异黄酮的方法，该专利提出涉及一种通过大豆种子萌动期分离大豆胚轴供萃取大豆异黄酮的方法。这种方法是将成熟饱满的大豆种子，经冷水浸泡萌动至初始萌芽状态，经脱皮、大豆子叶分瓣、子叶与大豆胚轴分离的方法得到胚芽，只有新鲜的能够萌发的大豆种子才能通过这种方法获得活的，可以生长的大豆胚芽。而且一粒大豆种子，只有一个胚芽，但胚芽在一粒种子中所占的重量比很小，占大豆总重量的2％～2.5％。一粒新鲜的种子经过这种方法去掉胚芽之后，拨掉的子叶必须马上进行加工处理，否则就会很快变质，失去加工价值，造成浪费。

因此，尽管胚芽中大豆异黄酮的含量很高，是子叶中的8～10倍，但由于胚芽的获得及产量十分有限，因此采用这种方法生产大豆异黄酮也受到很大的限制。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的大豆异黄酮提取方法，提出一种新的利用生物技术生产大豆异黄酮的方法。本发明不是利用在自然状态下的大豆种子或大豆植物体提取大豆异黄酮，也不是利用发根农杆菌感染大豆无菌苗产生发根，从发根中提取大豆异黄酮，而是利用发根扩大培养过程中使用过的培养基，从培养基中提取发根分泌到培养基中的大豆异黄酮，从而获得高效生产大豆异黄酮的效果。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

第一步，大豆无菌苗的获得：取成熟的大豆种子，用氯气或过饱和漂白粉精片溶液进行大豆种子灭菌，而后将大豆种子种脐向下接种到萌发培养基上，经过培养得到大豆无菌苗，为“第二步”发根农杆菌的侵染提供植物受体材料。

所述萌发培养基为现有的MS培养基，B₅培养基，或MS培养基的无机成分加上B₅培养基的有机成分，在温度为24℃-26℃条件下培养7-10天。

第二步，农杆菌侵染：取保存于-70℃冰箱的发根农杆菌利用经过活化的发根农杆菌侵染在“第一步”中得到的大豆无菌苗的不同部位，包括下胚轴，子叶节，子叶，真叶及根等部位。接种方法采用常规的农杆菌侵染方法，以及针刺胚轴，子叶节，子叶及真叶，根等部位的方法，也可以采用下胚轴切段，农杆菌侵染的方法。待被侵染部位长出毛状发根后，切下发根，置于发根培养基中进行发根培养。

所述发根培养基，为现有的MS固体或液体培养基，或B₅固体、液体培养基，培养温度为24℃-26℃。为第三步的大豆异黄酮提取材料。

第三步，大豆异黄酮的提取：用乙醇从第二步得到的发根及使用过的发根培养基中提取大豆异黄酮。

所述乙醇，其体积浓度为70％-80％。

经紫外分光光度计法检测发根中大豆异黄酮的不同成分及含量，测定培养发根的培养基中大豆异黄酮的总含量远远高于该培养基中所生长的全部发根中大豆异黄酮总量。因此这种方法在得到高大豆异黄酮含量的发根的同时，利用发根向培养基中分泌大豆异黄酮的特点，从使用过的发根扩大培养的培养基中提取大豆异黄酮，可以达到高效产生大豆异黄酮目的。