[发明专利]一种黄曲霉毒素G1人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄曲霉毒素G1与蛋白质载体大分子偶联制备人工抗原的方法。

背景技术

真菌毒素是产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。在已经发现的真菌毒素中黄曲霉毒素(aflatoxin，简称AFT)是毒性最强的真菌毒素，其毒性、致癌性和污染频率均居生物毒素的首位。黄曲霉毒素G1是已发现的黄曲霉毒素主要种类之一，它污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素的摄入量成正相关。黄曲霉毒素广泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等农产品和鱼肉等食品中，其污染食品及饲料的环节多，为此世界各国都规定了黄曲霉毒素食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，加强对食品及饲料中黄曲霉毒素的检测是增强食品安全性的一个重要环节。

目前黄曲霉毒素G1的检测方法主要有薄层层析法(TLC)和液相色谱法，这些分析方法或灵敏度达不到限量检测的要求，且前处理复杂、检测费用高、费时费力。因此，研究开发新兴的黄曲霉毒素G1快速检测技术是我国检测市场的迫切需求，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

近些年发展起来的免疫分析技术具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优点，并逐渐成为黄曲霉毒素等污染物快速检测技术研究的热点。抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。黄曲霉毒素G1分子量为328，属小分子化合物(≤1000)，不能直接刺激动物产生抗体，只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、多聚赖氨酸等载体蛋白质共价偶联后，才能转化为既具有反应原性又具有免疫原性的完全抗原，刺激动物产生抗体。目前，黄曲霉毒素B1等的人工抗原国外均有成功报道，而黄曲霉毒素G1人工抗原则至今未见报道，根本原因在于缺少黄曲霉毒素G1人工抗原制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术存在的不足而提供一种工艺简单、实用性强的黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1)人工抗原制备方法。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：首先用间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G₁分子二呋喃环的双键，使其形成活性极强的黄曲霉毒素G₁环氧化物，然后在室温下使黄曲霉毒素G₁环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。

按上述方案，所述的间氯过氧苯甲酸氧化黄曲霉毒素G₁分子二呋喃环双键的过程为：取间氯过氧苯甲酸6～10毫克溶于1毫升二氯甲烷中，配成浓度为6～10毫克每毫升的间氯过氧苯甲酸溶液，并用1～2毫升0.1～0.3摩尔每升pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液洗涤2～5遍；取黄曲霉毒素G₁1～5毫克溶于1～5毫升二氯甲烷中，配成浓度为8～10毫克每毫升的黄曲霉毒素G₁溶液，并加入1～5毫升0.1～0.3摩尔每升pH7.0～7.5的磷酸盐缓冲液；将上述间氯过氧苯甲酸溶液和黄曲霉毒素G1溶液混合，并在15～25℃条件下搅拌80～100分钟；将反应终溶液室温静置，待分层后弃去上层水相，保留有机相，该有机相即为黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液。

按上述方案，所述的黄曲霉毒素G₁环氧化物在两相体系中与载体蛋白质上的氨基相连过程为：取黄曲霉毒素G1环氧化物的二氯甲烷溶液(上述氧化步骤最终保留的有机相)1～3毫升，加到4.0～6.0毫升载体蛋白质溶液中，所形成的两相体系于室温下磁力搅拌2-6小时；反应终溶液用1000～3000转每分钟离心分离10～30分钟，取上层水相，并用二氯甲烷洗涤2～5次，保留水相溶液，黄曲霉毒素G1与载体蛋白质的偶联物即存在于最终保留的水相溶液中。

按上述方案，所述的透析、冷冻干燥过程为：将最终保留的黄曲霉毒素G1与载体蛋白质的偶联物水相溶液密闭于透析袋中，以0.1～0.2摩尔每升pH7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析2～3天，每间隔4～12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素G1人工抗原。

上述方案所述的载体蛋白质可用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸等生物蛋白质或人造多肽，溶于pH6.8～7.5的磷酸盐缓冲液中，配成浓度为0.5～10毫克每毫升的载体蛋白质溶液。

上述方案所述的偶联反应条件为在室温下于两相体系中自发反应实现偶联，无需其它双功能交联剂。