[发明专利]抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2和分泌该抗体的杂交瘤细胞系

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，它是由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2产生的。 

背景技术

颗粒体调节的靶细胞杀伤是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的主要效应途径。在人当中存在5种颗粒酶，分别是颗粒酶A、B、K、H和M。尽管颗粒酶A和B诱导的细胞死亡途径已经基本阐明，然而其它孤儿颗粒酶(K、H和M)在CTL调节的靶细胞杀伤中的作用远未阐明。颗粒酶K和颗粒酶A均属类胰蛋白酶，它们位于同一染色体上。研究发现颗粒酶K介导了快速的靶细胞死亡。类似于颗粒酶A，磷脂酰丝氨酸外翻、染色体凝集、核形态变化及单链断裂为颗粒酶K介导靶细胞死亡的主要特征。颗粒酶K介导的靶细胞死亡不依赖于caspase的激活。Caspase抑制剂Z-VAD及Bcl-xL的过量表达均不能阻断颗粒酶K介导的靶细胞死亡。此外，颗粒酶K亦不能够激活细胞裂解液及细胞内的Caspase3。颗粒酶K水解重组、细胞裂解液以及细胞内的SET。SET既是核小体装配蛋白，又是DNA酶NM23H1的抑制剂。颗粒酶K切割SET破坏了小体装配功能及对NM23H1的抑制作用。颗粒酶K进入靶细胞以后，DNA酶NM23H1及其抑制剂SET共同进入细胞核。DNA酶NM23H1的激活导致了染色体DNA的单链断裂。此外，颗粒酶K能够切割SET复合物中颗粒酶A的另外两个底物DNA结合蛋白HMG2及DNA氧化还原修复酶ApeI，表明颗粒酶K部分的提供了颗粒酶A的功能备份。 

线粒体途径在细胞凋亡过程中发挥重要作用。在凋亡进程中，一些凋亡前体蛋白如Cyto c、EndoG、SMAC、HtrA2和AIF等释放到细胞质中去。研究发现颗粒酶K能够诱导靶细胞线粒体肿胀、膨大及脊消失等形态特征的变化。通过线粒体氧化还原电势特异性染料DiOC6(3)染色，我们发现颗粒酶K能够诱导靶细胞氧化还原电势降低，从而使线粒体发生去极化。氧自由基特异性染料HE染色证明颗粒酶K诱导了细胞内ROS的升高。抗氧化剂NAC及氧自由基清除剂Tiron能够抑制颗粒酶K引起的ROS的升高，从而拮抗颗粒酶K引起的靶细胞死亡。颗粒酶K既能够切割体外重组的Bid又能破坏细胞裂解液及细胞内的Bid，从而引起线粒体Cyto c和EndoG释放。颗粒酶K通过作用于线粒体途径，加速了靶细胞死亡进程。

颗粒酶K单抗的潜在用途包括：1.用于检测组织和细胞或其裂解液中颗粒酶K的含量，可作为临床病人固有性免疫和适应性免疫水平的指徵； 

2.阻断颗粒酶K引起的细胞凋亡，临床上可作为免疫抑制剂用于器官移植和自身免疫病的治疗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2。 

本发明提供了一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，其特征在于，它是由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2产生的。以重组人颗粒酶K免疫Balb/C小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备的一株能稳定分泌特异性抗人颗粒酶K单克隆抗体的细胞株K42-D2。K42-D2单抗与重组人颗粒酶K及表达人天然颗粒酶K的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞无交叉反应。 

更具体地，本发明提供以下各项： 

1)一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，它由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2(CGMCC No.2309)产生。 

2)一种产生抗人颗粒酶K单克隆抗体K42-D2的杂交瘤细胞，其特征在于，它是保藏号为CGMCC No.2309的小鼠杂交瘤细胞系K42-D2。 

3)以上1)所述的单克隆抗体K42-D2在制备免疫抑制剂中的应用。所述免疫抑制剂可以含有其它辅剂或佐剂，其制备是本领域技术人员所公知的技术。 

4)用于检测颗粒酶K的含量的试剂盒，其包含以上1)所述的单克 隆抗体K42-D2。试剂盒的制备可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。 

5)根据以上4)的试剂盒，其中所述颗粒酶K的含量可作为临床病人固有性免疫和适应性免疫水平的指徵。 

6)根据以上4或5的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK92细胞或PBMC的颗粒酶K的含量。