[发明专利]人源抗狂犬病毒中和性抗体及其制备方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种人源单克隆抗体，具体涉及一种人源抗狂犬病毒中和性抗体，还涉及该抗体的制备方法与用途。

背景技术

狂犬病毒(Rabies Virus)是弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病毒属(Lyssavirus)血清I型病毒，呈典型的子弹状结构。大小约75×180nm。其基因组大小约为12Kb，为单股不分节段负链RNA。其基因组编码NP(核蛋白)，M1P(衣壳基质蛋白)，M2P(包膜基质蛋白)，GP(糖蛋白)，LP(转录酶大蛋白)等五种结构蛋白。这五种蛋白均具有抗原性。其中NP，M1P和LP与病毒RNA一起形成核衣壳(RNP)复合物。病毒颗粒中的糖类主要以糖蛋白和脂糖的形式存在。G蛋白位于病毒体表面，是狂犬病毒重要的抗原成分，可诱导机体产生中和抗体及细胞免疫，同时也是病毒入侵敏感细胞的重要物质。糖蛋白诱导和刺激机体产生免疫应答，在一定程度上完全依赖与完整的二级和三级结构。

由狂犬病毒引起的狂犬病是世界性人畜共患疾病，几乎遍及世界各个国家和地区。由于狂犬病一旦发病目前尚无法医治，死亡率几乎是100％。狂犬病的动物传染源广泛存在，在世界范围内，每年大约有6百万到1千万人暴露于狂犬病危险动物之下，并导致40000到70000人的死亡，控制难度较大，所以研制狂犬病的预防制品非常重要。

目前，应用于狂犬病的紧急预防性治疗药物主要是血源性免疫球蛋白，包括抗狂犬病毒马血清(ERIG)和人抗狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)。但是因为ERIG易引起过敏反应和血清病，以及HRIG存在潜在病毒污染的问题，使得临床使用存在安全隐患，而治疗效果也有待于提高。因此，研制血源性免疫球蛋白的替代新产品，开发人源性或者人源化基因工程抗体已十分迫切。

抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体，尤其是抗体库技术的出现，将抗体工程发展到了一个新阶段。利用噬菌体抗体库技术、转基因鼠技术等针对特定靶抗原筛选人源特异、高亲和力的抗体克隆，获得抗体新基因；进一步应用基因工程、细胞工程技术生产人源抗体和小分子抗体(如Fab，diabody)等，已经成为现在和未来抗体药物研发的主流技术趋势。

在国内外针对狂犬病毒的治疗性抗体研究中，值得关注的包括：(1)2001年，Ray K等人成功利用噬菌体抗体库技术筛选到狂犬病毒人单链抗体，筛选出的anti-GPRV(glycoprotein antigen of the rabies virus)ScFv-Fc分子具有中和活性。(2)武汉生物制品研究所的闭兰等人2004年从半合成噬菌体抗体库筛选出狂犬病毒G蛋白的人单链抗体A12，流式细胞仪(FACS)检测表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染细胞出现特异性反应，在快速荧光灶抑制实验(RFFTT)中表现具有完全中和病毒能力。(3)University of Massachusetts Medical School的Jamaica于2005年通过转基因鼠技术获得了抗体克隆HuMAB17，其c7单链抗体已经被验证能抗25种不同的狂犬病毒，被认为通过进一步的活性制备有希望成为HRIG的有效替代品。

发明内容

针对现有狂犬病毒感染的预防性治疗中所使用的抗血清制品的缺陷，本发明提供了新的抗狂犬病毒中和性人源单克隆抗体，该抗体的重链和轻链的可变区分别具有如序列表中序列2和序列4所示的氨基酸序列，其编码基因分别具有如序列表中序列1和序列3所示的核苷酸序列。

针对小分子抗体如单链抗体通常都存在的稳定性差的问题，本发明还提供了一种抗狂犬病毒中和性人源单克隆抗体的基因工程小分子稳定性改构体(3d-dsFv)，即三域二硫键稳定性Fvs。该改构体是在上述人源单克隆抗体的基础上改构而成，在抗体可变区VH和VL之间，通过定点突变引入二硫键形成位点VH46Cys和VL99Cys，在VH和VL之间添加二硫键；同时以重链CH1的5’端的12个氨基酸为连接肽顺序连接VH和VL，构建三域二硫键稳定性抗体。其中重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列8所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，轻链可变区的氨基酸序列如序列表中序列10所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。基因改构的3d-dsFv抗体结构的抗原结合特异性没有发生改变，不同条件下的稳定性获得了明显改善，实时SPR技术测定抗体亲和力也获得了提高，更加适合于应用。

本发明的人源抗狂犬病毒中和性抗体(HuAb-RV)，还包括对上述抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成的，具有相同功能的抗体。