[发明专利]共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组菌及其制备方法。

背景技术

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科、细小病毒属的成员，是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。病毒经口、鼻等黏膜感染是其主要感染途径，可引起怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎等临床症状。猪瘟(classical swine fever，CSF)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传染病，是危害养猪业的主要传染病之一。这两种疾病在世界范围内广泛分布，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。

但是多价、多联，可同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法，可作为同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。

本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。

本发明上述共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备：一、以质粒pMel_BacA-VP2-E29为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290基因进行BamHI和XhoI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290；三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化干酪乳杆菌；四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。

本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌可作为多价、多联，同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。本发明针对病毒经黏膜感染的特点，能有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应的疫苗。

乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，被公认为安全级(generallyrecognized as safe，GRAS)微生物。乳酸菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力，而本身又具有低免疫原性。因此，本发明选用干酪乳杆菌为活载体作为外源抗原的传递和表达系统，可刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答。

本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌依靠乳酸菌天然的抗菌、抗腹泻作用、猪瘟病毒T细胞表位E290多肽及猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白刺激的特异性粘膜免疫作用，达到同时预防猪细小病毒和猪瘟的目的，本发明对猪细小病毒和猪瘟的防治具有重要意义。

本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei393属于乳杆菌属(Lactobacillus)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2008年09月02日，保藏号为CCTCC M 208125。

附图说明

图1是具体实施方式八中PCR鉴定结果图，图2是具体实施方式八重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定的结果图，图3是具体实施方式八重组蛋白诱导表达Western-blot分析的结果图，图4是具体实施方式八目的蛋白分泌性表达SDS-PAGE鉴定的结果图，图5是具体实施方式八目的蛋白分泌性表达Western-blot分析的结果图，图6是具体实施方式八共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的ELISA检测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。

本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌中可以同时表达猪瘟病毒T细胞优势表位E290多肽和猪细小病毒起主要免疫保护作用的VP2蛋白。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：干酪乳杆菌为L.casei 393。其它与实施方式一相同。