[发明专利]产棒曲霉素真菌环介导等温扩增快速检测方法

权利要求书

1.环介导等温扩增检测产棒曲霉素真菌的试剂，其特征在于该试剂包括(1)-(4)：

(1)环介导等温扩增反应液：

包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L dNTP、4-8mmol/L硫酸镁、0.8-1.6μmol/L上游内引物、0.8-1.6μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中上游内引物：

5-ATATGCATTGGTGACGCTGCGG-ATGGTGATTGCTTTCCCTGA-3、

下游内引物：

5-GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCAAGTACGGGGTG-3、

上游外引物：5-TCGGACGAATTGACGTGATT-3、

下游外引物：5-TGAAGGAGCTCTGCACGATA-3、

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；

(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。

2.使用权利要求1中所述的试剂检测产棒曲霉素真菌的方法，其特征是依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检样品或真菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；

(2)进行产棒曲霉素真菌的环介导等温扩增反应：

A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温65℃扩增反应45-90min；

C.将温度调到80℃终止反应，3-5min后取出待检；

(3)显色检测：

在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为产棒曲霉素真菌。