[发明专利]A型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种A型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片及使用方法， 属于生物芯片领域。

背景技术

流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流行性感冒病毒(Influenza virus) 引起的一种急性呼吸道传染病。长期以来，流感一直是危害人类健康和公众安 全的严重传染病，每年由此造成的经济损失也十分巨大。据世界卫生组织估计， 每年全球流感患者约为6-12亿，其中约有3-5百万是重症流感患者，每年约有 30-50万人死于流感。流感病毒在分类上属于正粘病毒科，根据核蛋白(NP) 和基质蛋白(MP)抗原性的不同，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流 感病毒可以感染多种动物，是人类流感和动物流感的主要病原。A型流感病毒 根据其表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，可分为不同 的亚型，目前在水禽中已发现16种HA亚型和9种NA亚型。在过去的一个世纪 里，A型流感病毒引发4次人类流感大流行。A型流感病毒不仅血清型复杂，遗 传变异也十分活跃，变异的方式主要有核苷酸点突变积累引起的抗原漂移和不 同毒株基因节段重配引起的抗原转换两种。研究表明，每1-2年，H1和H3流 感病毒在人群免疫压力下都会发生一次大的抗原漂移，使疫苗接种预防效果和 血清学诊断结果大打折扣。

近十多年来，禽流感病毒，包括H5N1、H9N2和H7N7亚型，特别是H5N1 亚型病毒，在全球家禽中持续爆发流行。在一般认为流感病毒具有宿主限制性， 即禽流感病毒一般不易突破宿主种间屏障直接感染人。但近年来发生了多起禽 流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，越来越多的证据表明禽流感病毒， 特别是H5N1病毒，已经逐步获得直接感染人的能力。自1997年香港禽流感事 件，截止2008年3月，全球已有366例感染了H5N1病毒，其中死亡232例。 根据以往大流感的经验和当前高致病性禽流感肆虐的严峻现实，H5N1病毒一旦 获得在入际间传播的能力或与现在流行的人病毒基因重配，就可能引发新的流 感大流行。因此必须面对的问题是应该采取何种策略和技术储备来应对可能到 来的大流感。

流感病毒的有效检测技术对于指导临床预防和治疗流感具有重要意义，同 时也是流感监测和控制世界性流感大流行的重要技术支撑。除了流感病毒，临 床上引致人呼吸道疾病的病原体还有很多，包括某些病毒、细菌、支原体、螺 旋体、寄生虫等，因此轻型流感及散发流感在临床上与普通感冒及其它病原引 起的呼吸道疾病较难鉴别，对流感的确诊主要依靠实验室检测手段。自1933 年流感病毒被第一次分离以来，发展出了许多不同的诊断方法，这些方法各有 优缺点。目前流感的实验室诊断方法有病毒分离培养、检测抗体的血清学方法、 检测抗原的免疫学方法和基于PCR的分子生物学方法。用鸡胚或细胞分离培养 病毒是流感病毒鉴定的“黄金标准”，敏感性强，但需要3-7天时间，不适合早 期诊断。血清学方法可以检测抗体，主要包括血凝抑制试验(HI)、补体结合试 验(CF)、酶免疫试验(EIA)和间接免疫荧光法(IF)等。血清学检测需要采 集患者急性期和康复期双份血清，属于回顾性诊断，具有流行病学意义，但对 于急性早期诊断意义不大，且敏感性低。直接检测抗原方法有直接或间接荧光 试验、酶联免疫试验等，时间为2小时-1天，适合早期快速诊断，但敏感性低， 且不能进行大样本检测。分子生物学方法是针对病原核酸分子检测的一系列试 验手段，主要包括RT-PCR、多重PCR、real-time PCR、NASBA等，这些方法都 具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，可以对病毒进行定量和分型鉴定，但 缺点是不能对大量临床标本进行同时平行检测和筛查。针对流感病毒亚型众多、 血清型复杂和遗传变异迅速的特点，迫切需要建立一种敏感、特异的快速检测 方法，能够在同一时间平行地对大量样品进行检测，同时能对检测病毒进行分 型鉴定。近年来发展起来的基因芯片技术将为流感病毒的检测带来重大突破， 完全能够满足对流感病毒检测的上述要求。