[发明专利]一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法

权利要求书

1、一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)抗原的包被

以邻苯二甲酸二己酯半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液将包被抗原以1:5000～1:8000进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液200μL/孔作为封闭液，封闭2h；

(2)竞争反应

每孔分别加入以标准品稀释液PBST稀释的0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL系列浓度之一的邻苯二甲酸二己酯标准品或处理好的样品50μL到各自的酶标孔中，将免疫制备的邻苯二甲酸二己酯多克隆抗体以抗体稀释液：含0.1％明胶、含0.05％吐温-20、pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1:6000～1:9000比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)加酶标二抗

以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP以1:3000～1:5000进行稀释，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)显色

每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液100μL；用酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的邻苯二甲酸二己酯浓度。

2、根据权利要求1所述的邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，其特征在于显色液配方：A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；B液：60mg 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

3、根据权利要求1所述的邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，其特征在于标准品稀释液PBST为含0.15mol/L NaCl、含0.5％吐温-20的0.01mol/L、pH 7.4 PBST溶液。