[发明专利]慢病毒-胸苷激酶基因构型及其获得方法和临床应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因新构型，具体涉及一种慢病毒—胸苷激酶基因构型及其获得方法和临床应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的首要疾病，仅在我国每年因肿瘤死亡人数就达150万，根据目前癌症发病趋势，到2020年全球每年新增癌症患者人数将达到1500万。WHO预测21世纪癌症将成为人类的“头号杀手”。因此探索肿瘤治疗的新技术新方法具有十分重要的意义。基因治疗正以巨大的治疗潜力展现在人们面前，其发展代表了根治肿瘤的方向。

HSV1-TK基因结合GCV是最常用于临床基因治疗的自杀基因系统之一。1980年Steven L.Mc Knight测定了单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因全序列并确定了其开放读码框(Steven L.Mc Knight，Nucleic Acids Research，1980，8(24)：5949-5964.)，1986年Moolten博士偶然发现TK基因转染肿瘤细胞可使其对化疗敏感性增加(Moolten，Gancer Res，1986，46：5276-5281)，随后人们对TK基因的抗癌作用进行了研究，其治疗肿瘤的基本原理是，当TK被转入哺乳动物的细胞后，其编码的胸苷激酶可将无毒的前药GCV磷酸化为细胞毒性产物，阻止细胞DNA合成，从而使靶细胞走向死亡(Tomicic MT，MutatRes，2002，505：1-11)。

显然，如何获得胸苷激酶基因构型以及在临床应用具有高转染效率、高效稳定表达，是医学及生物学研究者们最为关心的课题。

发明内容

本发明的第一个目的，是为了提供一种在临床应用具有高转染效率、高效稳定表达的新型病毒载体基因构型，即慢病毒—胸苷激酶基因构型。

本发明的第二个目的，是为了提供一种慢病毒—胸苷激酶基因构型的制备方法。

本发明的第三个目的，是为了提供一种慢病毒—胸苷激酶基因构型的临床应用。

本发明的第一个目的可以采取如下技术方案达到：

慢病毒—胸苷激酶基因构型，其特征是：包括慢病毒载体LV、胸苷激酶片断和CMV启动子，全构件核苷酸长8.1Kb，胸苷激酶长1.1Kb、启始片断为18bp；全构件的DAN序列如序列表SEQ ID №：1所示；启始片断的序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC。

本发明所述慢病毒—胸苷激酶基因构型如图1所示。

本发明的第二个目的可以采取如下技术方案达到：

慢病毒—胸苷激酶基因构型的获得方法，其特征在于包括如下步骤：

1)在序列为ATGGCTTCGTACCCCGGC启始片断的诱导下，将慢病毒载体LV与TK基因cDNA，经酶切、连接、转化使胸苷激酶片断插入慢病毒载体中，构成初级构件；

2)将1)中的初级构件与辅助质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞培养扩增，提取培养上清液，80,0000g超速离心分离得到用于治疗的慢病毒—胸苷激酶基因产品。

所述TK基因cDNA可以如序列表SEQ ID№：2所示；其中，红色部分为TK基因序列，起始密码子ATG，终止密码子TGA，GAATTC为EcoR I的酶切位点，CCGCGG为Sac II的酶切位点，CCCGGG为Sam I的酶切位点。

为TK基因PCR扩增而设计的引物可以如序列表SEQ ID№：3所示。

用于DNA连接及载体构建过程可以如图2所示。

本发明的第三个目的可以采取如下技术方案达到：

慢病毒—胸苷激酶基因构型的临床应用，其特征是：可以利用本发明所述的慢病毒—胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因产品，该产品可以制成治疗神经胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等实体肿瘤的制剂。

本发明具有以下突出的有益效果：

1、本发明可利用慢病毒—胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因样品，根据本慢病毒—胸苷激酶基因构建系统在初步临床前预实验中表明，无论在体外肿瘤细胞系或动物模型中，该基因产品具有明确、高效、稳定抗肿瘤效应，安全性好，应用方便，其中对脑胶质瘤的临床前期应用中，有效率超过90％。应用本载体系统可克服常用的腺病毒载体表达时间短暂、腺病毒本身抗原表达可引起人体免疫反应的缺点，因此对手术不能完全切除、放化疗效果不佳的恶性实体肿瘤有很好的应用前景。

2、本发明可高效稳定转染多种人体实体肿瘤，例如神经胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等，具有高抗癌作用，对恶性脑胶质瘤临床前期应用中，有效率超过90％。

附图说明