[发明专利]结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，包括：

引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：

外引物1：GCGATATCTGGTGGTCTGCA、

外引物2：CCGTGGTTTCGAAAACAGCG、

内引物1：AGACCACTCGTACCCGTCGCTTTTCGGTGGTTAACGCGCTATC、

内引物2：ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGTTTTACCGTTGACCCCGTCTTCT；

Bst DNA聚合酶；

反应液：10mM脱氧核苷三磷酸dNTP，10×ThermoPol Buffer反映缓冲液，150mM硫酸镁MgSO₄；

样品预处理液：20mM Tris-HCl，pH 8.0；2mM乙二胺四乙酸，1.2％曲通Triton X-100；

荧光染料SYBR Green I；

阳性对照为人结核分枝杆菌基因组DNA。

2.一种结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：被检样品的预处理：提取结核分枝杆菌基因组DNA，过程如下：

1、取50μl结核病患者痰液于管中，1000rpm离心2分钟，去上清；

2、加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；

3、沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟；

4、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA

步骤二：特异性引物制备：

按照引物合成纯化-定量配制-浓度检测得到特异性引物；

步骤三：试剂盒组装，其中包括：

1.引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：

外引物1：GCGATATCTGGTGGTCTGCA

外引物2：CCGTGGTTTCGAAAACAGCG

内引物1：AGACCACTCGTACCCGTCGCTTTTCGGTGGTTAACGCGCTATC

内引物2：ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGTTTTACCGTTGACCCCGTCTTCT

2.DNA聚合酶

3.反应液：10mM dNTP，10×ThermoPol Buffer，150mM MgSO₄

4.样品预处理液：20mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM EDTA，1.2％TritonX-100

5.荧光染料SYBR Green I

6.阳性对照为人结核分枝杆菌基因组DNA；

步骤三：环介导恒温扩增反应：

1.在200ulPCR管配制反应体系：引物混合物4μl，反应液22μl，Bst DNA聚合酶1μl，模板DNA 2μl，加水至25μl。

2.将配制好的PCR管于65℃反应1小时；

步骤四：分析判断反应产物结果

在反应产物中加入2.0μl荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min；若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。