[发明专利]结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，特别的，本发明涉及一种检测结核分枝杆菌的基因分子诊断试剂。

背景技术

结核病至今仍然是全球范围内对人类健康危害最严重的细菌性传染病之一，据世界卫生组织统计，全世界现有结核病人2000万，每年新发生约900万例，每年死亡300万人，约1/3人群有潜伏性结核分支杆菌感染。由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病呈日益严重回升趋势。

目前对结核分枝杆菌有多种检测方法，从涂片镜检为主的微生物学诊断方法(国家标准GB/T 14926.48-2001)，到特异抗原的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

PCR(聚合酶链式反应)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌诊断过程中发挥着重大作用。PCR方法尽管操作起来比较简单易行，扩增产物在短时间内能够大量聚集，但是操作过程必须有高精密的温度循环装置，从而使得这种强有力的方法不能在实地广泛应用。除了PCR方法以外，还有其他核酸恒温扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)，自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1h小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermalamplification of DNA，简称LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，该方法通常是按如下步骤进行：

步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；

步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；

步骤三、进行环介导恒温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；

步骤四、分析判断反应产物结果。

虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，例如：

1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；

2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。

为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明解决的技术问题是构建一种检测时间短、特异性强、灵敏度高、检准率高的恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法来检测结核分枝杆菌，使其反应程序化，并可广泛应用于临床、食品、水产等领域的检测。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

一种结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其包括：

引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：

外引物1：GCGATATCTGGTGGTCTGCA、

外引物2：CCGTGGTTTCGAAAACAGCG、

内引物1：AGACCACTCGTACCCGTCGCTTTTCGGTGGTTAACGCGCTATC、

内引物2：ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGTTTTACCGTTGACCCCGTCTTCT；

Bst DNA聚合酶；

反应液：10mM脱氧核苷三磷酸dNTP，10×ThermoPol Buffer反映缓冲液，150mM硫酸镁MgSO₄；

样品预处理液：20mM Tris-HCl，pH 8.0；2mM乙二胺四乙酸，1.2％曲通Triton X-100；

荧光染料SYBR Green I；