[发明专利]来自多个核酸的蛋白质表达

权利要求书

1.用于在CHO细胞中重组产生分泌到培养基中的异源免疫球蛋白的方法，其包括：

a)提供CHO细胞，其

-适合在悬浮培养中生长，

-适合在无血清培养基中生长，

-无支原体，

b)提供核酸，其包含

-原核复制起点，

-赋予对原核选择剂抗性的第一个核酸序列，

-编码所述异源免疫球蛋白重链的第二个核酸序列，和编码所述异源免疫球蛋白轻链的第三个核酸序列，

由此，提供第一个转染载体，其包含所述提供的核酸，和赋予对第一种真核选择剂抗性的额外的第四个核酸序列，

由此，提供第二个转染载体，其包含所述提供的核酸，和赋予对第二种真核选择剂抗性的额外的第四个核酸序列，其中所述第二种真核选择剂不同于所述第一种真核选择剂，

c)转染所述CHO细胞，其中所述转染包括以下顺序的以下步骤：

(i)用所述第一个转染载体转染所述CHO细胞，

(ii)通过在培养基中选择生长来选择在(i)中转染的CHO细胞，所述培养基含有第一个转染载体赋予对其抗性的第一种真核选择剂，

(iii)用所述第二个转染载体转染(ii)中所述选择的CHO细胞，

(iv)通过在培养基中选择生长来选择在(iii)中转染的CHO细胞，所述培养基含有所述第一个转染载体赋予对其抗性的所述第一种真核选择剂，并且含有所述第二个转染载体赋予对其抗性的所述第二种真核选择剂，

d)在所述第一种和所述第二种真核选择剂存在下，在适合于表达所述第二个和/或第三个核酸的条件下，在培养基中培养所述转染的CHO细胞，

e)从所述培养基中回收所述分泌的异源免疫球蛋白，并由此在CHO细胞中产生异源免疫球蛋白，其被分泌到所述培养基中。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述CHO细胞是CHO K1细胞、或CHO DG44细胞、或CHO XL99细胞、或CHO DXB11细胞、或CHODP12细胞。

3.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述第二个和/或第三个核酸含有杂合内含子核酸序列。

4.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述第一个转染载体和所述第二个转染载体仅在赋予对所述真核选择剂抗性的核酸中不同。

5.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述方法还包括：

步骤b)后，步骤b1)：

b1)提供核酸，其包含

-原核复制起点，

-赋予对原核选择剂抗性的第一个核酸序列，

-编码所述异源免疫球蛋白重链的第二个核酸序列，和/或编码所述异源免疫球蛋白轻链的第三个核酸序列，

由此，提供第三个转染载体，其包含所述提供的核酸，和赋予对第三种真核选择剂抗性的额外的第四个核酸序列，其中所述第三种真核选择剂不同于所述第一种真核选择剂并也不同于所述第二种真核选择剂，

并且在步骤c)(iv)后还包括以下步骤(v)和(vi)：

(v)用所述第三个转染载体转染(iv)中选择的所述CHO细胞，

(iv)通过在培养基中的选择生长来选择在(v)中转染的CHO细胞，所述培养基含有第一个转染载体赋予对其抗性的所述第一种真核选择剂，和所述第二个转染载体赋予对其抗性的所述第二种真核选择剂，以及第三个转染载体赋予对其抗性的所述第三种真核选择剂，

并且在步骤d)中还包括用于培养所述转染的CHO细胞的所述培养基还包含第三种真核选择剂。

6.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于步骤c)和步骤d)在相同培养基中进行。

7.权利要求6的方法，其特征在于所述培养基是无血清培养基，或添加确定动物来源组分的无血清培养基，或无动物来源组分的培养基，或无蛋白质培养基，添加确定动物来源组分的无蛋白质培养基，或确定成分的无蛋白质培养基，或化学成分确定的培养基。

8.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于在所述步骤d)中所述培养在少于500升体积中所述真核选择剂存在下进行并且所述培养在500升或更高体积中在所述真核选择剂缺失条件下进行，并且在不含所述真核选择剂的培养基中进行所述分泌的异源免疫球蛋白的所述回收。