[发明专利]实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物、探针及方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种实时荧光PCR检测用引物、探针以及利用该引物、探针对鸡源性成分进行鉴别检测的方法。

背景技术：

目前，国内外应用于检测食品和饲料中所含动物成分的技术主要有三种：饲料显微镜学方法、ELISA方法及PCR特异扩增法，在实际检测中应用最多的是PCR特异扩增法，PCR特异扩增法又有普通定性PCR、实时荧光PCR、巢式PCR等。实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术基础上发展而来的，在扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，即检测靶核苷酸序列扩增状态，以进行结果判定。它的主要优点是：(1)在闭管状态下进行扩增产物检测，无需PCR产物的后处理，避免了扩增产物污染而致的假阳性，保证了结果的可靠性；(2)探针杂交特异性更强、灵敏度更高，在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，荧光信号由仪器自动收集，进一步提高了灵敏度；(3)无需酶切位点存在，无需进行酶切、电泳，节省了时间，PCR后无需后续处理，操作更简单快速；(4)安全无污染，DNA测序表明该方法准确性很高。

随着市场经济的发展，肉制品的生产与消费一直保持持续发展的势态，但是某些肉制品中却添加有鸡源性成分(食品标签中并未注明)。由于没有相应的引物、探针，迄今为止还没有对食品中鸡源性成分的定性检测方法，以至于不能及时发现食品中鸡源性成分的存在，严重损害了消费者的利益。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于检测鸡源性成分的实时荧光PCR引物、探针及方法。

本发明的技术解决方案是：

一种实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物和探针，其特征在于：所述引物是由序列为CAAACAACCCTGCAAACAAAATTA的上游引物P1和序列为GGGCTTGAGAATTGGTCGAA的下游引物P2组成的引物对；探针序列为：CCCCTGAACCTGACCATGAACCTAAGCTT，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

本发明同时涉及一种用上述的引物和探针进行实时荧光PCR检测鸡源性成分的方法，其特征在于：

a.提取待检样品基因组DNA；

b.以所提取的DNA作为模板，加入上述引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应；

c.设置扩增反应条件95℃20s，1个循环；95℃5s、60℃31s，40个循环，记录样品反应的Ct值；

d.在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照、阳性对照，所述确定质量控制指标是：

空白对照：以ddH₂O为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；

阴性对照：以非鸡源性物种基因组DNA为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；

阳性对照：以鸡基因组DNA为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于34；

e.样品判定结果是：

待测样品鸡源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出鸡源性基因；

待测样品鸡源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出鸡源性基因；

待测样品鸡源性基因检测Ct值在36～40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出鸡源性基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出鸡源性基因。

本发明设计了实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性。采用实时荧光PCR特异扩增法可以定性分析食品中是否含有鸡源性成分，发挥了实时荧光PCR检测技术的优点，进一步完善了食品检测体系，加大对消费者利益的保护力度。

附图说明：

图1是本发明实施例检测鸡源性成分阳性样品的荧光PCR扩增图。

具体实施方式：

1.所用引物和探针：

选择鸡mtDNA作为对象，设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。

实时荧光PCR引物和探针序列包括：

上游引物P1：CAAACAACCCTGCAAACAAAATTA；