[发明专利]一种具有免疫增强活性的茶树菇胞外粗多糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有免疫增强活性的茶树菇胞外粗多糖的制备方法。属生物工程技术领域。

背景技术

茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。其提取物多糖对小自鼠肉瘤S-180和艾氏腹水癌的抑制率高达80-90％，是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。研究表明，茶树菇深层发酵获得的菌丝体所含的主要营养成分以及氨基酸与人工栽培的子实体相似。为深层发酵茶树菇产多糖提供了理论依据。

目前，人们获得真菌多糖的途径主要是从真菌子实体提取而得，但随着需求量的增大，野生资源有限，人工栽培周期长且容易污染杂菌，受病虫害侵蚀，而菌丝体培养周期短，染菌少，故应该探索在生物反应器内进行液体深层发酵以获取胞外多糖的途径，为开辟工业化液体深层发酵生产真菌多糖提供可靠依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有免疫增强活性的茶树菇胞外粗多糖的制备方法。

本发明的技术方案为：将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，将发酵液浓缩，将浓缩液醇沉，脱蛋白，透析后冷冻干燥得到茶树菇胞外粗多糖。

本发明发明的茶树菇胞外粗多糖经初步的研究确认，基本无毒，具有显著的免疫增强活性。可以作为原料应用于保健食品等领域。

具体来说，首先，我们发现市售茶树菇可以经过组织分离法在平板上长出菌丝体。通过菌丝体发酵获得含有胞外多糖的发酵液，发酵液中的胞外多糖可以经过浓缩，醇沉，脱蛋白，透析，冷冻干燥获得。由此奠定了以茶树菇为原料通过深层发酵获得胞外粗多糖的基础。

其次，在对发酵过程中起始pH、发酵温度、摇瓶转速，装液量等条件进行系统的考察和对比后，我们发现，在适当的发酵条件下获得的发酵液经过浓缩，醇沉，脱蛋白，透析后可以提高发酵液中胞外多糖的产量。

上述过程中，斜面培养基为PDA培养基，摇瓶种子培养基为PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0，发酵培养基为玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL，培养条件为起始pH6.0，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d，多糖提取方法为将发酵液浓缩后调PH值为5.5，添加4倍体积发酵液的95％乙醇，4℃醇析17h，8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后用Sevage法去除游离蛋白质，蒸馏水透析去除无机盐，冷冻干燥，粉碎后得到茶树菇胞外粗多糖。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例一

1.菌种培养

出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；

(1)组织分离法

斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；

组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；

(2)摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；

培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；

(3)摇瓶发酵培养

发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL；

培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；

2.胞外粗多糖的提取