[发明专利]猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及其制备方法，具体涉及一种用于猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及其制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又称蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)引起的急性高度接触性传染病。

PRRSV属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，根据病毒的抗原性、基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(LV株为代表株)和美洲型(ATCC2VR2332株为代表株)，两种毒株间氨基酸的同源性为78％～81％。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圆形，直径约45-65nm，含有20-35nm的核衣壳，呈二十面体对称，外绕一脂质双层膜，表面有纤突。已经证实，PRRSV有6种结构蛋白，它们是核衣壳蛋白(N)、非糖基化膜蛋白(M)和4种糖基化膜蛋白(GP2、GP3、GP4和GP5)。

目前对PRRSV的各结构蛋白免疫原性的研究已经比较清楚。该病毒感染猪体后，血清中抗PRRSV的免疫球蛋白主要是针对GP3、GP4、GP5和M蛋白，这些蛋白由于可产生中和抗体而成为亚单位疫苗及其它新型疫苗研究的主要候选抗原。此外，血清中针对N蛋白产生的抗体水平虽然很高，但是N蛋白却因不具有中和活性而不能提供免疫保护。

GP4具有诱导中和抗体的活性，其中和表位区位于暴露于胞外亲水区的aa40-79，其中aa59-67组成的基元构成了此中和表位区的核心。Oleksiewicz等应用噬菌体展示技术进行该蛋白的抗原表位定位，筛选到一个强抗原性的表位aa48-76，随后试验证明该表位在各分离株间保守存在。这是个矛盾的结论。因此，GP4上的这个表位是否保守还有待进一步确证。美洲型PRRSV的GP5上有个线性表位，位于aa27-30，为非中和性表位；aa37-45是糖基化的中和表位；aa170-201是非中和性表位，但是有研究表明其C端(aa180-197)存在优势表位，缺失C端50个氨基酸的表达蛋白与感染猪血清的反应性消失相关，说明C端有很强的抗原性及在维持GP5结构上有很强的作用。也有人认为GP5上存在2个中和表位，一个为线性表位，一个为构象表位。付利芝的博士论文《PPRSV GP4和GP5多表位串联基因的表达及在小鼠诱导的免疫反应》以PPRSV BJ-4的GP5(aa29-60)和GP4(aa33-70)抗原表位为基础，构建成多表位串联基因，得到纯化的融合蛋白，免疫小鼠得到比较高的抗体效价。这两个肽段是靠柔性氨基酸PCG和GGGGG来连接的。江云波等在GP5的覆盖表位和中和表位之间插入一个通用的辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)，免疫小鼠，取得比较高的抗体水平。以上研究资料表明，GP4和GP5蛋白是PRRSV病毒的重要中和抗原，可以刺激机体产生中和抗体和细胞免疫。因此，本发明选定GP4和GP5蛋白为主要研究蛋白。

疫苗接种是预防猪繁殖与呼吸综合症最有效的方法，国内外已有商品化的猪繁殖与呼吸综合症疫苗，既有灭活疫苗，也有用弱毒株制备的弱毒活疫苗。PRRS灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险，便于贮存和运输、对母源抗体的干扰作用不敏感等优点，因此人们首选灭活疫苗来预防和控制PRRS。国内分离的PRRSV CH-1a灭活疫苗是经Marc-145细胞系传代、多次克隆纯化，筛选出嗜Marc-145细胞生长的毒株。该毒株的细胞培养液经化学试剂灭活后，配以医用油佐剂，制成了繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(郭宝清等，2000)，已成为国内首批商品化的PRRS疫苗，并对3月龄仔猪间隔20天进行了2次免疫，结果在首次免疫后5天就可检测到病毒特异性抗体，28天达到高峰，在首免后的56天还可检测到抗体。当猪场受到威胁或刚刚发生PRRS时，可采用该疫苗紧急预防接种，实践证明采取这种措施可有效阻止PRRSV的侵袭和缩短PRRS的病程，从而有效降低因PRRS造成的损失。经繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫的母猪可通过初乳给新生仔猪提供被动免疫，保护仔猪在哺乳期间免受PRRS的侵袭。虽然灭活疫苗使用后不存在安全性的问题，但是该灭活疫苗存在免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生期较长的缺点，不太适合仔猪免疫。而仔猪和架子猪带毒是猪场PRRSV持续存在的最重要原因，因此通过灭活疫苗难以控制和根除PRRSV在猪场的存在和流行，因此仅依靠灭活苗免疫给猪体建立牢固的免疫力是不够的。