[发明专利]透明质酸的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纯化透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(玻尿酸)是一种由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖重复键结所构成的线性高分子黏多醣(glycosaminoglycan)，其分子量最高可达1.3×10⁷道尔顿。透明质酸是动物体内常见的物质，广泛分布于结缔组织、表皮、神经组织当中，也是细胞间质的主要成份，已知其对细胞增生与移动都有相当大的贡献。

透明质酸具有高度的亲水性，尤其在水溶液中因为透明质酸具有高分子量及大量的带电基团的特性，更能展现其高度黏着性及吸水性。正因为此特性，透明质酸可维持皮肤的弹性及张力，所以透明质酸早已广泛应用于各式各样的保养品及化妆品中，此外透明质酸的应用还包含膝关节注射剂、手术防沾黏、伤口癒合、胚胎培养、组织再生等医疗领域。

传统的透明质酸是由动物组织萃取，如鸡冠、猪皮、牛眼玻璃体等，但是由于动物来源的透明质酸品质不易控管，因此近年来发展出细菌发酵制法。发酵法更适合大量生产，也比较容易控管产出品质，其优点还包括可以降低生产成本、提高单位生产量、避免病毒颗粒或动物蛋白所造成的过敏反应。目前最常使用的发酵菌株为链球菌(Streptococcus)。

先前许多分离发酵液中透明质酸的方法大都使用多种且大量有机溶剂及清洁剂，这些方法不但昂贵而且对生态而言也是一种破坏。如专利US4517295、US4780414、US5563051及US2006012987中所揭露的纯化透明质酸的方法就使用了大量的有机溶剂以沉淀杂质。

除了上述大量使用有机溶剂的纯化方法外，也有部分研究使用过滤及调整pH值等方式改善方法，如专利US6489467揭露一种通过调整pH值及透析的方法纯化透明质酸，但是该专利没有揭示连续改变pH值的萃取方法；CN200610090586揭露一种使用磁场强化膜过滤发酵液的方法，该专利所使用的过滤膜并不适合大量生产透明质酸。

因此，有必要提供一种纯化透明质酸的方法以满足市场的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，而提供一种通过pH连续变化及透析过滤的方法纯化透明质酸。

因此，本发明提供一种纯化来自生物原料的透明质酸的方法，该方法包括：(a)离心透明质酸粗萃液或发酵液后保留上清液；(b)调整上清液的pH值到酸性，并以微过滤膜过滤所述上清液；(c)调整步骤(b)所得滤液的pH值到中性并将该滤液置于贮存槽中；(d)以连续式pH值变化搭配超滤装置过滤贮存槽中的滤液，及(e)以纯水透析贮存槽中溶液。其中步骤(b)调整上清液至pH 2.0～4.0，较佳的实施例中，将上清液调整至pH 3.0。

本发明所使用的生物原料是动物组织萃取液或菌体发酵液，其中动物组织萃取液的来源可包含鸡冠、猪皮、鱼皮或牛眼玻璃体。具体而言，本发明使用的生物原料以菌体发酵液为主，其中菌体可以是兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)等菌种。

本发明的操作条件：微过滤膜的孔径约为0.1～2.0μm；超滤膜孔径约为分子量20kDa～200kDa；穿膜压力约为1～50psi。较为适当的操作条件：微过滤膜的孔径约为0.2～1.0μm；超过滤膜孔径约为分子量20kDa～100kDa；穿膜压力约为10～30psi。最佳的操作条件：微过滤膜的孔径约为0.45μm；超滤膜孔径约为分子量50kDa；穿膜压力约为15psi。

如前所述，本发明最大的特征在于连续改变贮存槽中溶液的pH值，其改变的方式是以不同pH值的溶液为超滤时的透析液。透析液可以是纯水、氯化钠水溶液、氯化镁水溶液或氯化钙水溶液；较佳的实施例是使用氯化钠水溶液作为透析液。

操作时使用氯化钠水溶液浓度为0.1～0.5M；溶液pH为1.0～10.0。一开始将氯化钠水溶液置放于供液箱后，先调整为pH 1.0～3.5，然后开启两个蠕动泵，使得氯化钠得以进入贮存槽，而原本贮存槽中液体也得以顺利进入超滤膜组，其间要维持控制透析液进入贮存槽的流量与超滤膜组滤出端(Permeate)流量相同，使得贮存槽内溶液体积不变以维持透明质酸浓度恒定。直到贮存槽中溶液的pH值到达4.0后关掉两个蠕动泵，再调整供液箱中氯化钠溶液为pH 8.0～10.0，完成后即可打开两个蠕动泵，继续进行超滤，直到贮存槽中溶液的pH值到达7.0为止。最后将供液箱中的氯化钠水溶液置换成纯水，以纯水进行透析，即完成纯化步骤，而最后贮存槽中剩余液体即为透明质酸。