[发明专利]一种氧化型低密度脂蛋白的制备方法及应用技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种低密度脂蛋白的制备方法，具体涉及一种氧化型低密度脂蛋白的制备方法及应用，属医学检测技术领域。

背景技术

心肌纤维化是指心肌细胞外基质(ECM)中胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。它是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果，这种病理变化在肥厚性心肌病、心力衰竭等多种心血管疾病中存在，现认为其与心律失常、心功能障碍甚至心源性猝死密切相关。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，长期的压力超负荷、炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等是其主要原因，涉及到神经内分泌系统、免疫系统等。上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁/自分泌系统的调控紊乱，这些旁/自分泌系统不仅诱导心肌损伤，也是心肌纤维化的促进因子。随着人口老龄化的进展，心肌纤维化越来越引起了人们的重视，因此，发现心肌纤维化危险因素及对其机制的研究愈发显得重要。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在体内由低密度脂蛋白(LDL)经氧自由基氧化而来，它对心血管系统有着广泛影响：在泡沫细胞形成过程中起关键作用；诱导单核细胞向内皮细胞的粘附和向内皮下的趋化；促进巨噬细胞增殖退化；促进血小板粘附、聚集、血栓形成；加剧心脏和血管的炎症反应诱导巨噬细胞和平滑肌细胞产生血小板衍生生长因子(PDGF)，促进平滑肌细胞移行；损伤内皮细胞等。Cucina A等研究发现氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)能刺激平滑肌细胞分泌bFGF，刺激内皮细胞分泌TGF-β1，提示ox-LDL在心肌纤维化过程中可能起到重要作用，尤其是重新认识强化降脂治疗，及阻断ox-LDL的信号通路可以作为防治心肌纤维化的措施之一，对于临床治疗具有现实意义，目前国内外均处于研究阶段。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种氧化型低密度脂蛋白的制备方法及应用技术，该方法通过对氧化型低密度脂蛋白的提取与鉴定、ox-LDL体外促进心肌纤维化的研究，利用本发明提取的氧化型低密度脂蛋白对心肌纤维化的作用，探索心肌纤维化的发生机制，阻断其信号通路可促进抗心肌纤维化药物的研发。

本发明是以如下技术方案实现的：一种氧化型低密度脂蛋白的制备方法，其特征是：它包括提取正常人血清，经高速离心机离心，去除上层乳糜微粒后调节密度，超速离心机离心两次，取上层低密度脂蛋白，琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后用氧化剂氧化得到氧化型低密度脂蛋白，经琼脂糖凝胶电泳及MDA试剂盒测氧化值，BCA法测定蛋白浓度。

所述的催化氧化为用硫酸铜催化氧化，浓度为1～10μmol·L^-1。

所述的BCA法测定蛋白浓度是将大鼠分离的心肌细胞分别培养在90个培养皿中(每皿含培养液2mL)，培养密度为2×10⁵个心肌细胞/皿，随机选30个培养皿为空白对照组(其中加入相应体积的PBS缓冲液使低密度脂蛋白、氧化型低密度脂蛋白终浓度为0μg·mL^-1)，分别孵育0h、6h、12h、24h、48h；再选30皿为低密度脂蛋白对照组(加入低密度脂蛋白使其终浓度为120μg·mL^-1)，分别孵育0h、6h、12h、24h、48h；其余30皿为实验组(加入氧化型低密度脂蛋白使其终浓度为120μg·mL^-1)，分别孵育0h、6h、12h、24h、48h，用ELISA法检测细胞培养液上清中TGF-β1和bFGF浓度，留取细胞培养上清，在3000转/min下离心10min后冻存于-80℃，用ELISA试剂盒检测各组培养液中的TGF-β1、bFGF浓度。。

所述的氧化型低密度脂蛋白的应用技术，其特征是：将PBS缓冲液、低密度脂蛋白及氧化型低密度脂蛋白经大鼠尾静脉注入其血管内，每天注射一次，空白对照组中注射相应体积的PBS缓冲液，实验组注射氧化型低密度脂蛋白(血浆中终浓度为40μg·mL^-1)，低密度脂蛋白对照组中注射相同浓度的低密度脂蛋白。分别于第1、7、14、21及28天，在麻醉状态下取出实验大鼠心脏，用冰冻生理盐水冲洗干净，取心室肌放入4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片厚度为5μm，每个石蜡块取10张切片进行Masson染色，普通光镜观察形态学改变，图像采用Image pro plus 6.0图像分析处理软件手动计算绿色纤维和红色胶原的面积，计算胶原容积分数，用ELISA法检测血浆中P I CP浓度，分别于第1、7、14、21及28天采血，在3000转/min下离心10min后得到血浆，-80℃冻存，用ELISA试剂盒检测血浆P I CP浓度。