[发明专利]能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株能在芽胞表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用。

背景技术

911事件之后的炭疽芽孢袭击事件，引起了人们对生物武器的恐慌。炭疽杆菌形 成的芽孢具有存活时间长，易于传播，引起的炭疽杆菌病发病时间快和死亡率高等特 点，在我国列为乙类传染病，并且是恐怖主义者首选武器之一。

炭疽杆菌毒性菌株含有两个大质粒，分别是编码毒素基的pXO1质粒(184.5kbp)， 合成荚膜相关基因的pXO2质粒(95.3kbp)。强毒株需要两种质粒的存在，缺少pXO1 则不产生毒素，即为弱毒菌；缺少pXO2则不形成荚膜，比野生型菌毒力低百倍，因 此炭疽杆菌致病因子主要是荚膜和炭疽毒素两个方面，而能够引起机体对其产生免疫 保护应答的成分岂今发现主要是炭疽毒素中的保护性抗原(PA)，另外炭疽杆菌的芽 孢成分、水肿因子(EF)及致死因子(LF)均有增强免疫保护的作用。我国当前应用 于疫苗的A16R株是只具有pXO1大质粒的弱毒株，但残留一定的毒性，存在一定的 副作用等缺点。我们已经消除pXO1毒性质粒，建立“无毒”的炭疽杆菌芽孢突变株， 并且获得专利(专利号：ZL200610007229.3)。

根据PA蛋白的晶体结构，可将其分成4个结构域：结构域1(PAD1)由1～ 258氨基酸残基组成，含有弗林蛋白酶(furin)的切割位点和LF及EF的结合位点； 结构域2(PAD2)由259～487氨基酸残基组成，参与蛋白七聚体的形成及LF、EF 进入细胞质孔道的形成；结构域3(PAD3)由488～595氨基酸残基组成，参与七聚体 的形成；结构域4(PAD4)由596～735氨基酸残基组成，为细胞受体结合结构域，也 就是说PAD4能与细胞表面的炭疽毒素受体结合，从而引导PA在细胞表面形成七聚 体进而使得LF或EF进入细胞内。

发明内容

本发明的目的是提供一株能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽杆菌突变株及其应 用。

本发明所提供的能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽杆菌株，是将pagA_D4基因插入 到炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端获得的菌株。

所述pagA_D4基因具有自GeneID：2820165的5′端第596-735位核苷酸序列；所述bclA 基因具有自GeneID：62823670的5′端第1-389位核苷酸序列。

所述能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株还经过去除构建过程中引入 的抗生素标记。

所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)为减毒活疫苗菌株，具体为炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)AP422 CGMCC №.1569。

所述能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株优选为炭疽芽孢杆菌AP422 (Bacillus anthracis)CGMCC №.3404号。炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)CGMCC №.3404号是通过同源重组将pagA_D4基因插入到炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽 孢蛋白bclA基因未端，并采用重组酶将引入的卡那抗性基因敲除，通过大量鉴定筛选 获得的一株能在芽孢表面展示PAD4蛋白，并且无抗生素标记的炭疽芽孢杆菌株。

所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424，已于2009年11月05日保藏于中 国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市 朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3404。

本发明还提供一种能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株的获得方法，是 将将pagA_D4基因插入到炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端。

所述pagA_D4基因具有自GeneID：2820165的5′端第596-735位核苷酸序列；所述bclA 基因具有GeneID：62823670的5′端第1-389位核苷酸序列；所述pagA_D4基因通过同源重 组的方法敲入所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)中。

上述能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株作为炭疽杆菌活芽孢疫苗。