[发明专利]一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种厌氧细菌的分离方法。

背景技术

可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌主要用于含有硫酸盐和硝酸盐污水的处理，该功能菌株快速分离和鉴定对于污水处理工艺的改进以及污水处理的效能提高具有重要的意义，同时该菌株在微生物降解机理研究方面具有重要的科研价值。目前，现有可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法对厌氧环境要求严格，厌氧条件控制困难，分离过程中工作量大，分离周期较长，同时现有的分离方法不易获得纯菌株，还存在即使获得了菌株，却不是目的功能菌株，而且非目的菌株对硫酸盐、硝酸盐和亚硝酸的降解效果不好。可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌分离困难，导致许多的基础理论的研究无法进行，且随着环境的日益恶化，特别是工业废水硫酸盐和硝酸盐污染的加剧，可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离和相关的研究凸显出重要性。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有分离同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的方法分离周期较长、不易获得纯菌株的问题，而提供了一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法。

本发明同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行PCR扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5'- AC[C/G]CACTGGAAGCACG -3'，下游引物为5'-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3'，第一套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、56℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min，PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTPs(0.3mmol/L)、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E和2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为5'- TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3'，下游引物为5'- AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG -3'，第二套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min， PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E、2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品和20μL的dH₂O组成。