[发明专利]制备高纯度表柔红霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物表阿霉素的前体表柔红霉素的制备方法，具体而言，涉及采用微生物发酵法制备高纯度表柔红霉素的方法。

背景技术

柔红霉素以及以其为原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(epirubicin)是目前临床上十分重要的抗肿瘤蒽环类抗生素。表阿霉素的心脏毒性和骨髓毒性比阿霉素更低，而抗肿瘤的效果相当或更高。表柔红霉素(4’-epi-daunorubicin)是工业生产表阿霉素的重要前体，其与柔红霉素的差别仅在于分子中脱氧糖C4位羟基构型不同。由化学合成法从柔红霉素到表柔红霉素需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，并会造成环境污染。如果采用微生物发酵方法直接生产表柔红霉素将会大大节约成本，提高效率。目前现有技术可以采用微生物发酵方法直接生产表柔红霉素，但发酵产物的产量较低。

文献Production of the antitumor drug epirubicin and its precursor by agenetically engineered strain of

该方法步骤烦琐，且必须使用硅胶为介质的反向层析填料来完成分离纯化工艺。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简单、适合大规模工业生产、具有很好的商业价值的提取微生物发酵产生的表柔红霉素的方法。尤为重要的是，本发明方法所得的表柔红霉素的最终纯度将提高到97％以上。

本发明所述的制备表柔红霉素的方法包括以下步骤：

a)预处理后的表柔红霉素发酵液上大孔弱酸树脂，用添加盐酸的丙酮或甲醇水溶液进行洗脱；

b)将表柔红霉素洗脱液蒸干后溶于水中，然后用氯仿进行萃取；

c)表柔红霉素萃取液上非极性吸附树脂，再用丙酮水溶液进行洗脱，制得表柔红霉素。

本发明中，表柔红霉素发酵液的预处理过程按照下列步骤进行：取表柔红霉素发酵液，将其pH值调至3-5，离心，取菌丝体，用丙酮或甲醇水溶液抽提，蒸干抽提液，用蒸馏水溶解，抽滤，即得所述预处理后的表柔红霉素发酵液。

根据本发明，将所述预处理后的表柔红霉素发酵液的pH值调整为5-8，优选调整为7.0。

根据本发明的一个优选的实施方式，表柔红霉素发酵液的预处理过程按照下列步骤进行：表柔红霉素发酵液调pH为3.0，静置一段时间后高速离心取菌丝体，用1.5倍体积的丙酮抽提菌丝体中表柔红霉素，抽滤除去菌丝体，即得预处理后的表柔红霉素发酵液。

上述表柔红霉素发酵液的预处理步骤可以对发酵液进行初步纯化，得到纯度为5％左右的表柔红霉素发酵液。但是，该预处理步骤不是必须的，也可以直接对表柔红霉素发酵液进行以下处理。

表柔红霉素发酵液中的杂质非常多。发明人通过筛选各种树脂，发现当表柔红霉素水溶液经过大孔弱酸吸附树脂时，很多极性杂质吸附不上去，而表柔红霉素能够很好的被交换吸附上去。本发明所述大孔弱酸树脂的型号可以包括CD40和D152。

根据上述方法的步骤a)，所述第一种有机溶剂选自丙酮或甲醇，优选第一种有机溶剂为丙酮。所述丙酮的浓度可以是20-80％，该浓度越高越好，但考虑到成本问题，优选50％的丙酮，当用50％的酸性丙酮水洗脱液洗脱时表柔红霉素被完全洗下，而很多非极性的杂质保留在树脂上，从而提高了表柔红霉素的纯度。

根据本发明一个优选的实施方式，a)步骤中所添加HCl的浓度可以为0.01-0.1N，优选0.05N。

通过步骤a)，可以得到纯度为20％左右的表柔红霉素洗脱液。

根据上述方法的步骤b)，所用氯仿的体积优选为和表柔红霉素水溶液的体积相等，且氯仿的浓度优选为100％。水相和氯仿相的比例没有严格的限定，但每一相的比例不能少于两相体积之和的30％。

该步骤的主要作用是除去了大部分的水溶性杂质，使得表柔红霉素的纯度有较大的提高。同时，它也除去了一些极性低的杂质。

优选所述b)步骤采用调节pH的方法进行萃取和反萃取。具体而言，先将所述pH调至8-9，将表柔红霉素萃取到氯仿有机溶剂相中，再将pH调至3-5，将表柔红霉素反萃取到水相。

根据本发明一个优选的实施方式，根据b)步骤将表柔红霉素洗脱液蒸干溶于水后，用氯仿-水体系进行萃取，当调节pH为8-9时，表柔红霉素主要在氯仿相，而当调节pH在3-5时，表柔红霉素主要在在水相，因此采用调节pH的方法先将表柔红霉素萃取到氯仿相中，再反萃取到水相，从而除去杂质。

通过步骤b)，可以得到纯度为71％左右的表柔红霉素萃取液。