[发明专利]一种基于转化体的分泌型RpfB因子的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及细菌复活促进因子B(RpfB因子)的表达与纯化，特别涉及一种基于转化体的分泌型RpfB蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

1、Rpf因子的发现及其活性

Rpf(Resuscitation-promoting factor，Rpf)最初是在M.luteus(藤黄微球菌)中发现，该因子可以在皮克(10^-12)水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长，由于Rpf的功能类似于真核生物的生长因子，所以被称为细菌的生长因子。Rpf除能促使休眠菌复活和生长以外，对正常生长的细菌也有相应的效果；其机制可能是参与了细胞间的信号转导。目前已查明了Rpf氨基酸顺序并确定了编码这种蛋白的基因，相似的Rpf基因广泛分布在高G+C％含量的革兰氏阳性菌中。研究发现M.Luteus的Rpf蛋白结构域具有与Rpf蛋白一致的生物学功能，能够代表Rpf的完整活性。

经杂交试验证实在多种分枝杆菌中也存在Rpf基因，在结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)H37Rv株和牛分枝杆菌的基因组中Rv0867C(RpfA)、Rv1009(RpfB)、Rv1884C(RpfC)、Rv2389C(RpfD)和Rv2450C(RpfE)基因所编码的蛋白均具有Rpf样作用域，即高度保守的70aa残基(可能就是Rpf样蛋白的功能作用域)。上述五个基因与M.luteus的Rpf基因同源，MTB的Rpf结构域具有M.luteus菌Rpf结构域相似的功能，即单个结构域与Rpf样蛋白的生物学功能一致，代表了Rpf的完整活性。其中四个基因编码的蛋白是分泌蛋白，推测这些基因编码的蛋白可能也具有Rpf作用-促进细菌生长。

Rpf因子的作用机制尚不清楚，推测可能在细胞外发挥作用，参与了细胞间的信号转导。Rpf蛋白发挥作用在两种情况下是必需的，一种是将低密度细菌接种于培养基时，繁殖生长需要Rpf。Rpf对10²CFU/ml的BCG生长具有明显促进作用，但对10⁵CFU/ml的BCG作用不明显。另外一种情况是休眠菌复苏时需要Rpf。在Ecoli中表达的任何一种Rpf样蛋白，在皮克浓度就可以刺激BCG休眠菌的生长。Zhu等克隆表达了结核分枝杆菌的Rpf样蛋白，发现其作用有时相性，即对于潜伏期缓慢生长的细菌培养物作用显著，而对培养基中活跃生长的MTB的影响很小。通过细胞壁酶谱分析，发现Rpf蛋白具有溶菌酶样结构域，由于在休眠菌的细胞壁中，新生肽聚糖被惰性肽聚糖所代替，使得其被膜成为一个“茧”样结构，在胞壁复苏时，必须由特定的胞壁溶解酶对其进行溶解，而Rpf就是行使这种功能的蛋白质。

采用大规模插入突变分析发现Rpf样蛋白并不是H37Rv株生长所必需的，而突变RpfB可明显减缓H37Rv的生长速度，提示这5种Rpf样蛋白在功能上有一定的重叠，其中RpfB在结核分枝杆菌的生长中发挥着较为重要的作用。分析RpfB的蛋白组成发现其为一膜蛋白，且具有多种T细胞和B细胞抗原表位，所以该蛋白不仅可能是治疗结核病的新切入点，而且有可能作为新型亚单位疫苗用于防止结核病的复发。

2、结核病临床诊断中存在的问题

TB是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，而TB的控制真正需要的是质量可靠、操作简单、快捷的诊断技术。目前我国常规的TB诊断方法仍是结核菌素试验结合抗酸染色和分离培养。结核菌素试验结合抗酸染色的方法准确率较高，但漏检率亦高，其主要原因是人群普遍接种BCG后，结核菌素试验的诊断价值已大大降低，常用的涂片染色镜检法是抗酸染色法，属低敏感性方法，阳性率不到40％。另外，抗酸性是分枝杆菌属的特征，并非结核菌种的特性。因此，涂片染色镜检阳性时，应仅报告抗酸杆菌阳性，但临床上往往是将“抗酸杆菌阳性”等同于“结核菌阳性”，这实际上是临床医生结合其它有关的临床资料的综合诊断，并非细菌学的认定。有报道指出，临床诊断为TB的细菌分离株中，经种鉴定后发现有2％～5％为非结核分枝杆菌。分离培养的检出率也很低，尤其对于持留菌、休眠菌及代谢异质菌无法成功培养。