[发明专利]开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种核酸适体探针及其在肿瘤检测中的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的常见疾病。对肿瘤细胞进行准确的免疫分型有利于实现肿瘤的早 期诊断和治疗，从而提高肿瘤治愈率。抗原-抗体反应是免疫学诊断的基础，过去几十年间抗 体技术的迅速发展对肿瘤诊断及治疗相关研究做出了巨大贡献，然而近年来核酸适体的出现 却使得抗体技术受到前所未有的挑战。

核酸适体(又称Aptamer)是利用核苷酸之间严格的识别能力和亲和力而设计的人工合 成寡核苷酸，并通过指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选而获得。核酸适体不仅具有类似抗体对靶标高特异性和高亲和 力的特点，更在许多方面优于抗体，如：分子量小、无免疫原性、靶标种类丰富(包括酶、 生长因子、抗原、基因调节因子、细胞黏附分子、完整的肿瘤细胞等)、合成方法简单且重 复性好、修饰灵活以及便于长期贮存和常温运输等等。这些特性使得核酸适体作为肿瘤诊断 探针得到了广泛的关注和认可，而基于核酸适体的肿瘤识别与检测方法正逐渐成为一种新的、 普遍适用的技术，为肿瘤细胞分型、诊断和治疗相关领域的发展带来了新的契机。

“Aptamers Evolved from Live Cells as Effective Molecular Probes for Cancer Study.”《Proc. Natl.Acad.Sci.USA》2006，103(32)：11838-11843；Dihua Shangguan，Ying Li，Zhiwen Tang，et al. 发展了一种以全细胞为靶标的cell-SELEX技术，针对白血病细胞筛选出一组特异性核酸适体， 并利用荧光染料标记的核酸适体成功实现了对正常人骨髓抽吸混合细胞中目标白血病细胞的 有效识别与检测。随后，该研究小组又采用cell-SELEX技术筛选出分别针对淋巴瘤、肝癌、 肺癌等多种肿瘤细胞的一系列核酸适体，并将其广泛应用于多种肿瘤细胞或组织的分型与检 测中。然而，目前基于核酸适体建立的肿瘤检测方法，还主要是采用单一的信号标记手段如 荧光或放射性标记，仅仅将核酸适体作为靶向分子，利用其与目标和非目标细胞之间的亲和 力差异来实现对肿瘤细胞的识别。由于核酸适体与非目标细胞之间必然存在一定的非特异性 吸附，这类方法无法满足对复杂混合体系中肿瘤细胞的便捷、快速、高特异和高灵敏的分析 要求，限制了临床检测中肿瘤早期诊断的实现和相关治疗的开展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有较高稳定性、特异性、 灵敏性的开关式核酸适体探针，还提供一种操作简单、快速、灵敏、特异、成本低的开关式 核酸适体探针在肿瘤活细胞及活体检测中的应用方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种开关式核酸适体探针，该核酸适体 探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元，所述探针 本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段(设为片段1)和与该核酸 适体片段形成6～12对碱基互补序列(连续的)的核酸片段(设为片段2)，所述核酸适体片 段和核酸片段通过一7～15nm长的连接片段(设为片段3)连接形成一发夹型结构；所述核 酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标肿瘤细胞杂交核酸适体片段的能 力。该技术方案中，所述片段1具有对目标肿瘤细胞的特异性识别能力；所述片段2由于与 片段1形成6-12对碱基互补序列，因此片段2的主要作用是与片段1的部分序列杂交以形成 稳定的发夹构型，同时其杂交能力不会影响目标肿瘤细胞对片段1的竞争性结合；所述片段 3的主要作用是将片段1和片段2连接成一条探针本体。所述片段2应当是与片段1靠近端 部荧光发生(或熄灭)单元处的序列互补，以使得探针两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元 能尽可能靠近。

上述的开关式核酸适体探针中，所述荧光发生单元优选为荧光染料分子或荧光纳米颗粒； 所述荧光熄灭单元优选为荧光熄灭基团或者为具有荧光淬灭效果的功能化纳米材料。