[发明专利]构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法

权利要求书

1.构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1).vgb在大肠杆菌中的克隆与鉴定

①PCR扩增vgb：PCR引物设计：根据Khosla(1988)测定的vgb核酸序列(GenBank Accession No.M30794，142bp-582bp)合成引物，以透明颤菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得分子量约0.5kb vgb片段。

引物：5’......CGCGGATCCATGTTAGACCAGCAAACC......3’

                  Bam HI

      5’......CCCAAGCTTCTATTATTCAACCGCTTG......3’

                  Hind III

②大肠杆菌表达载体pQE V构建：将vgb基因片段和质粒pQE-30分别经BamHI和Hind III双酶切消化后，通过T4DNA连接酶，得到重组质粒pQE V，CaCl₂转化法将含有vgb基因的载体质粒pQE V转入E.coli M15感受态细胞，在含有50μg/ml Amp的LB平板培养基上37℃培养12-18h，挑取抗性单菌落，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，并进行Bam HI和Hind III双酶切，对pQE V进行电泳鉴定，用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h进行连接反应。重组子的筛选和鉴定采用酶切法。结果获得分子量约3.9kb阳性克隆。

(2).vgb在E.coli M15中的表达与鉴定pQE V转入大肠杆菌后在含氨苄青霉素LB培养基中振荡培养过夜，离心后的菌体呈红色，而不含vgb的大肠杆菌菌体为白色，这表明vgb已经在大肠杆菌中得到了高效表达。用SDS-PAGE电泳检测vgb表达的血红蛋白，分子量约为16kDa。对转化后的大肠杆菌进行蛋白印迹和CO示差光谱分析，结果分子量为16kDa。在OD_420nm出现典型的吸收峰值，表明vgb在转化后的大肠杆菌中表达了有活性的血红蛋白。

(3).构建含有vgb基因的糖多孢红霉菌载体及鉴定

①PmerR启动子的PCR扩增：根据文献(Brunker et al，1998)中启动子PmerR的序列(GenBank Accession No.X65467)2538bp-2723bp设计引物，以Streptomyces lividans基因组DNA为模板，PCR扩增PmerR启动子，启动子PmerR的序列如下：

2521  gggatttcat gggcagggcc tttccaccag cagctattcg tctgcccgca tagtaaggtg

2581  gcggtctgca atacggcaag ccgcatagga atgggtccgg cgtccggcgc tggaccccac

2641  tgagggaggt agtgctgtgc tccaggcaca caccggttac gacctggcga tcatcggctc

2701  gggcgccggc gcattcgccg cgg

引物：5’......TGCACTGCAGGCCTTTCCACCAGCAGCT......3’

                     Pst I

      5’......CGCGGATCCCCGCGGCGAATGCGCCGG......3’

                  Bam HI

②糖多孢红霉菌非必需区片段1和片段2的PCR扩增：根据文献(Brown，DP etal，1994)中糖多孢红霉菌染色体中的序列(GenBank Accession No.L11597)设计两对引物，以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增出21-321bp和441-698bp两段DNA片段，分别称为片段1和片段2。包含片段1和片段2的碱基序列如下：

21   cctccgccac tccctcggct cgacctgcgc aaaccccaca acagggaacg agggaacgcc

81   ccgcgcacac cgcccgacac ccccggaatc cggggttgtc gacaccggcc cccgcttccc

141  tcccccggcc ccgggagtcc ggggacgcaa cgcggctgct gctgaccgtc gagcaggccg

201  cccgccggtt gtcggtcggc cgcaccacga tgttcaagct catcaagtcc ggcgacgtcg

261  actcggtacg catcggccac gcccgccgcg tccccgtcga agcgctcacc gcctacatcg

321  accgcctggc ccggggcgcg gcatgaccac cgccgtcacg tcgcccagtc ggcccaatat

381  cggggtggga gggggtgccg tcccagccgt cccagccgtc ccaccgcagg tcagcgcggg

441  acggcaacac gccctgggac ggcacgagcc gtcccaccga ccccagcggc gcgcactgct

501  gggacggcac gagccgtccc acgcctgcaa gccgtcccag cctgaccagc actgggacgc

561  ttgggacggc tgggacggct accccctcac cccgtaccgc cgggccgcgc gaggccagtg

621  aacgggccag tgagcccggc aggggccagt ggatatccac tggccatcca ctggcccggc

681  ccactgggca cggcctgcga

片段1引物：5’......CCCATCGATCCTCCGCCACTCCCTCGG......3’

                        Cla I

           5’......GGCGAGCTCTCGATGTAGGCGGTGAGC......3’

                        Sac I

片段2引物：5’......TGCACTGCAGACGGCAACACGCCCTGGG......3’

                        Pst I

          5’......TCCCCCGGGGCAGGCCGTGCCCAGTGG......3’

                        Sma I

③报告基因GUS的获得：由于GUS(葡糖苷酸酶)在底物X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)的存在下能够使菌落呈现蓝色。便于从pBlue V转化菌株中筛选出含有vgb的重组菌株。用Hind III和Sac I双酶切质粒pBI101，电泳后回收2.0kb大小的片段，即获得GUS基因的片段。

④糖多孢红霉菌表达载体pBlueV的构建：将PCR扩增的vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因分别用各自对应的限制内切酶消化，用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h。进行连接反应后，反复转化大肠杆菌，经阳性克隆筛选，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体。以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳、PCR实验以及用限制性内切酶的酶切反应反复鉴定目的基因和载体，直至鉴定vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因在体外已经连接到一起，然后再插入质粒pBluescript SK多克隆位点。