[发明专利]手足口病LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测手足口病病原体的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测手足口病病原体的方法。

背景技术

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的全球性传染病，世界大部分地区均有流行报导，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，在少数患者中可引发心肌炎、肺水肿、脑膜脑炎等并发症。引起该病的主要病原体为柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie A16，CAV16)和肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)。传统的手足口病病原体检测方法包括病毒分离与中和试验鉴定两步，大概要一周以上的时间，而且步骤繁琐，费时费力。环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)通过识别靶序列上6个特异区域的引物，在一种具有链置换特性的DNA聚合酶作用下，能够在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA靶序列，在反应体系中加入逆转录酶，可以检测RNA靶序列。LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应体系中是否形成白色沉淀来定性判断。

发明内容

本发明的目的在于利用LAMP技术，研制出适用于临床检测手足口病病原体柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV 71型的试剂盒及检测方法。

本发明的技术方案：

一种手足口病病原体检测试剂盒，包括以下成分：

(1)病毒RNA提取试剂

病毒RNA的抽提可以采用常规的Trizol法，也可使用各生物公司生产的病毒RNA抽提试剂盒。

(2)LAMP检测反应液

①反应液Cox A16-用于检测柯萨奇病毒A16型

含有以下成分：

10 x LAMP缓冲液(200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/LMgSO4，100mmol/L(NH4)SO4，1.0％Tritonx-100)；100mmol/L MgSO4；25mmol/L dNTP；5mol/L betaine(甜菜碱)；20umol/L引物CoxA16-FIP；20umol/L引物CoxA16-BIP；5umol/L引物CoxA16-F3；5umol/L引物CoxA16-B3；DEPC处理水。

其中引物序列为：

CoxA16-FIP：

5-AAGTRGGTTTCGGAGCCCCTTTTTTAGCCAAACCCAATGGTGAG-3

CoxA16-BIP：

5-TTYGCTTGGCARACTGCTACCATTTTAGGGGACTGACACTTGAGC-3

CoxA16-F3：5-ACATGCGCTTTGAYGCTGAA-3

CoxA16-B3：5-GCACTGGCTGGTGACATG-3

②反应液EV71-用于检测肠道病毒71型

10 x LAMP缓冲液(200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/LMgSO4，100mmol/L(NH4)SO4，1.0％Tritonx-100)；100mmol/L MgSO4；25mmol/L dNTP；5mol/L betaine(甜菜碱)；20umol/L引物EV71-FIP；20umol/L引物EV71-BIP；5umol/L引物EV71-F3；5umol/L引物EV71-B3；DEPC处理水。

其中引物序列为：

EV71-FIP：

5-CAACTTCCCCGGTGGGTGTGTTTTCCTACATGCGCTTTGATGCA-3

FV71-BIP：

5-TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCTTTTGGGGTTAGTGGCGGTTTG-3

EV71-F3：5-GCGCAAATGCGTAGAAAGG-3

EV71-B3：5-AGGGTCTGACAGCTTGACAA-3

③酶混合液

包括Bst DNA聚合酶(8U/ul)和AMV逆转录酶(8U/ul)

本发明的另一技术方案是：

一种手足口病病原体LAMP检测试剂盒检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的检测方法，其主要技术步骤包括：