[发明专利]H5亚型禽流感病毒变异株的多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于对禽类及其产品是否感染传染病进行检测的方法，确切讲是一种用多重PCR检测禽类及其产品是否感染H5亚型禽流感病毒变异株的方法。

背景技术

禽流感是由正粘病毒科A型流感病毒引起的禽类的一种从呼吸系统到全身败血症等多种症状的传染病。高致病性禽流感是由H5N1亚型禽流感病毒引起，其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一，被国际兽疫局定为法定通报传染病。目前我国对高致病性禽流感主要采取强制免疫和扑杀相结合的防控策略，免疫压力的存在会导致病毒发生变异，导致变异株的产生，导致临床免疫失败，有必要开展流行病学调查工作。2008年底，华东地区出现H5N1亚型高致病性禽流感病毒变异株，给当地养禽业造成了巨大打击。因此，建立一种快速准确的检测H5亚型禽流感病毒的技术，能够及时确定病原体，有利于人们及时采取有效防控措施，对于减少养殖场经济损失具有重要意义。

近年来，RT-PCR方法在禽流感的检测中得以广泛的应用，该方法可以弥补禽流感经典检测方法的不足，而且具有良好的特异性和敏感性。1995年Wright等报道应用RT-PCR方法区分A、B、C型禽流感，我国刘燕等建立了鉴别H5和H9亚型AIV的多重RT-PCR方法，谢芝勋等建立了鉴别H5和H7亚型AIV的多重RT-PCR方法，Xie Z等建立并优化了检测A型AIV且同时能区分H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR。

发明内容

本发明对检测AIV的RT-PCR方法进一步探索，设计了针对禽流感病毒的型(A型)、亚型(H5)以及clade7的变异株的特异引物，建立了多重RT-PCR检测方法。该方法在同一个RT-PCR反应体系中不仅可以快速鉴定A型流感病毒，而且可以确定是否是H5亚型和变异株的禽流感病毒。

本发明选取禽流感病毒相对保守的M基因设计型特异性引物；选取HA基因比较保守的区域设计一对引物，用以确定是否是H5亚型禽流感病毒；变异株其主要变异主要集中在HA基因，所以就选取与以前毒株变异较大的区域设计一条引物，用以检测是否为clade7的变异株。

本发明所采用的技术方案是：从待检禽的气管或泄殖腔试子或血液或器官组织或尿囊液中提取全基因组RNA，再以RNA为模板，以AIV基质蛋白(M)、血凝素(H5)基因为靶基因设计型特异性引物、亚型特异性引物和鉴定变异株的引物进行RT-PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定；

M1             5′-ATTGGGACTCATCCTAACTCTA-3′

M2             5′-CGTCAACATCCACAGCACTC-3′

HA1            5′-ATRCCATTYCACAACATACACC-3′

HA2            5′-TCCYTGCCATCCTCCCTC-3′

HA3            5′-TAATACATACCCACCAATAAAGGTGA-3′

HA2            5′-TCCYTGCCATCCTCCCTC-3′

其中，R为A或G；Y为C或T。

电泳图谱中出现300bp的型特异条带的是A型流感毒株；出现173bp的亚型特异条带的是H5亚型流感病毒，出现559bp特异条带的是变异株。

利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增，建立多重RT-PCR检测方法，该方法不但能够在1个反应体系中鉴定A型流感病毒和H5亚型禽流感，而且可以同时确定是否为clade 7变异株的H5亚型禽流感病毒，而经典的鸡胚增殖的方法没法确定分离的禽流感毒株是否为变异株，所以此方法在临床样品快速筛检和AIV亚型鉴定等方面有重要的应用价值。为禽流感和变异株的快速诊断提供了新的方法，为疫苗的选择提供指导作用。

附图说明

图1是多重RT-PCR特异性试验结果

其中M：100bp Marker；1：H1AIV；2：H3AIV；3：H4AIV；4：H5clade 2.3.4AIV；5：H5clade 7AIV；6：H6AIV；7：H8AIV；8：H9AIV；9：H10AIV；10：H11AIV；11：NDV；12：IBV.

图2是多重RT-PCR敏感性试验结果

其中M：100bp Marker；1：460ng/μl AIV RNA；2：46ng/μl AIV RNA；3：4.6ng/μl AIVRNA4：0.46ng/μl AIV RNA.