[发明专利]大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28 K的RNAi植物表达载体

权利要求书

1.大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体，其构建方法为：

1)pBI121的nos序列的改造

设计引物P1、P2，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Asc I位点的nos终止子片段，

上游引物P1：5`-AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA-3`

下游引物P2：5`-GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3`

PCR扩增产物连入pMD19-T simple vector中，测序验证；

设计引物P3，与下游引物P2，以含Asc I位点的nos终止子片段为模板，扩增得到含Sac I和Asc I两个酶切位点的nos片段，

上游引物P3：5`-CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA-3`

PCR扩增产物连入pMD19-T simple vector中，测序验证，得PMD-nos；

质粒pMD-nos和质粒pBI121分别EcoR I/Sac I双酶切，回收pMD-nos中的小段和pBI121的大片段后连接，得到中间载体pBI121-nos；

2)pBI121的GUS序列的改造

设计引物P4、P5，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Pac I位点的GUS片段，

上游引物P4：5`-CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA-3`

下游引物P5：5`-CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC-3`

PCR扩增后，连入pMD19-T simple vector中，测序验证；

设计引物P6，与上游引物P4，以含Pac I位点的GUS片段为模板，扩增得到上游含Xba I和Pac I两个酶切位点的GUS片段，

上游引物P6：5`-CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT-3`

PCR扩增产物连入pMD 19-T simple vector中，测序验证，得pMD-GUS；

质粒pMD-GUS和质粒pBI121-nos分别Sac I/XbaI双酶切，回收pMD-GUS中的小片段和pBI121-nos中的大片段后连接，得到载体pBI121-nos-GUS；

3)质粒pBI121-nos-GUS和质粒pCAMBIA3301分别EcoR I/Hind III双酶切，回收pBI121-nos-GUS的小片段和pCAMBIA3301的大片段连接，得到载体pGSB；

4)将CHAS内含子序列连入载体pGSB

选用‘南农32’作为材料，取幼嫩叶片，按照TaKaRa公司提供的基因组DNA提取试剂盒说明书要求，提取大豆叶片基因组DNA；

设计引物F1、F2，以基因组DNA为模板，获得含酶切位点的CHAS片段，

上游引物F1：5`-CCTTAATTAA GTGTAAGAATTTCTTATGTTACA-3`

下游引物F2：5`-CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA-3`

PCR扩增产物连入pMD19-T simple vector中，测序验证，得pMD-CHAS；

质粒pMD-CHAS和质粒pGSB分别Sac I/Pac I双酶切，回收pMD-CHAS的小片段和pGSB的大片段，连接得到载体pGSBI；

5)Gly m Bd 28K干扰片段的获得

选用‘南农32’作为材料，取幼嫩荚果，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据NCBI上公布的GenBank：AB046874.1大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 28K的序列信息设计特异引物，进行常规聚合酶链式PCR反应，分别扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列SEQ IDNO.13和反义序列SEQ ID NO.14，

扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列引物：

上游引物R1：5`-CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3`

下游引物R2：5`-TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT-3`

扩增Gly m Bd 28K干扰片段的反义序列引物：

上游引物R3：5`-GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG-3`

下游引物R4：5`-CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3`

PCR扩增产物分别连入PMD19-T simple vector中，测序验证，得pMD-28S和pMD-28A；

6)Gly m Bd 28K RNAi植物载体的构建

pMD-28A与pGSBI分别Pac I/XbaI双酶切，回收pMD-28A的小片段与pGSBI的大片段连接，得到含反义片段的载体pGSBI-28A；

pMD-28S与pGSBI-28A进行Sac I/Asc I双酶切，回收pMD-28S的小片段与pGSBI-28SA的大片段连接，得同时含Gly m Bd 28K正义和反义片段的RNAi植物表达载体pYZ，Xba I/Asc I双酶切验证，构建成功。

2.权利要求1所述过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体pYZ的应用。