[发明专利]预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株，其保藏号为CGMCC No.3746。

2.鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No.3746在制备1型鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。

3.将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No.3746灭活得到的1型鸭病毒性肝炎疫苗。

4.制备DHAV-SD株病毒液的方法，包括如下步骤：将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No.3746在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为DHAV-SD株病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-1细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No.3746在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液的方法包括如下步骤：

①将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No.3746接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为生产用种毒；

②将生产用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为制苗用种毒；

③将制苗用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收集上清液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤①、步骤②和步骤③中：接种所述宿主细胞时MOI均为0.001，培养时间均为48～72小时；所述步骤①、步骤②和步骤③中：培养时间优选为48小时；所述步骤③中，通过5000rpm离心30～40min收集上清液。

7.如权利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为BHK21细胞；所述宿主细胞在所述接种前先进行如下扩增培养：

(1)将冻存的BHK21细胞37℃水浴融化，800rpm离心5min，取沉淀；用细胞培养液悬浮沉淀，得到2×10⁵细胞/ml的细胞悬液，37℃、5％CO₂静置培养至每毫升含有1×10⁶细胞；

(2)在步骤(1)的基础上消化细胞，然后重悬于细胞培养液中，使每毫升含有2×10⁵细胞，然后在如下条件下培养至每毫升含有1×10⁶细胞：pH7.4，溶解氧饱和度为50％、37℃，100转/min。

8.一种制备1型鸭病毒性肝炎疫苗的方法，是将权利要求4至7中任一所述方法制备的DHAV-SD株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到1型鸭病毒性肝炎疫苗。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述灭活的方法如下：在所述DHAV-SD株病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时，得到灭活后病毒液。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述乳化的方法如下：将3体积份油相、1体积份水相和1％(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01％(质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下：将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1.6～1.8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下：将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混匀。