[发明专利]一种重金属酶标物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重金属酶标物及其应用。

背景技术

重金属是环境与农产品中的重要污染物质，可以通过食物链在动物及人的体内尤其是肝脏内富集，对人类健康会带来严重的危害。铜是生命体生长所必须的微量元素之一，但是高浓度的铜会对生命体产生毒害作用。水生生物对铜离子的毒害作用尤为敏感。

目前，重金属铜的分析方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光/质谱法、X-射线荧光光谱法、电位溶出分析法以及近几年发展的生物传感器检测法等。但是用这几种方法检测铜离子需要昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时，不能用于现场快速检测。与仪器分析法相比，直接酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。获得好的抗原酶标物是建立高灵敏度的直接ELISA检测方法的前提。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备重金属酶标物的方法。

本发明所提供的制备重金属酶标物的方法，包括如下步骤：

(1)将酶活化，得到活化后的酶；

(2)将所述活化后的酶与络合物进行交联反应，得到重金属酶标物；

所述络合物是按照包括如下步骤的方法制备的：

Ⅰ、将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂；

Ⅱ、将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述重氮化的螯合剂的偶联物；

Ⅲ、将金属离子的溶液与所述偶联物混合，进行络合反应，得到所述络合物。

上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述活化的方法包括如下步骤：将酶的水溶液与NaIO₄水溶液混合，反应，得到活化的酶；

上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与络合物进行交联反应的方法包括如下步骤：将所述络合物溶于碳酸盐缓冲液中，再加入所述活化后的酶，反应，得到所述重金属酶标物；

上述任一所述制备方法中，所述步骤Ⅰ中，所述重氮化的方法包括如下步骤：将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件包括：温度为0-5℃、避光和时间为15min；所述温度优选为0℃或4℃；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的配比为4mg∶2×10^-3mol∶1.2×10^-4mol；

上述任一所述制备方法中，所述步骤Ⅱ中，所述偶联反应的条件包括：温度为4℃-10℃或4℃，pH值为8.5-9.0或8.5，反应时间为4h-24h或4h；所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的投料摩尔比为10∶1；

上述任一所述制备方法中，所述步骤Ⅲ中，所述络合反应的条件包括：温度为25℃、pH值为7.5和时间为12h；所述偶联物与所述金属离子的投料摩尔比为1∶20。

上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述活化的方法中，所述反应的温度为25℃，反应的时间为20min；(酶与NaIO₄的投料配比为10mg酶∶0.02mol NaIO₄；)

上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为2小时，所述反应的PH值为8.0；(所述活化后的酶与所述络合物的投料摩尔比为2∶1；)；

上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述活化的方法中，在所述反应后，包括如下用乙二醇终止反应的步骤：向所述反应的体系中加入乙二醇水溶液，25℃搅拌反应10min；其中乙二醇与NaIO₄的投料摩尔比为1∶1；

上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述将活化后的酶与所述络合物进行交联反应的方法中，在所述反应后，包括如下步骤：向所述反应的体系中加入NaBH₄，4℃搅拌反应2小时。

上述任一所述制备方法中，所述重金属为铜；所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述酶为辣根过氧化物酶。

所述对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式为：

由上述任一所述制备方法得到的重金属酶标物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种重金属酶标物。