[发明专利]一种凡纳滨对虾fx151微卫星DNA标记鉴定fx151遗传变异图谱的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济动物对虾属凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）fx151微卫星DNA标记的鉴定遗传变异图谱的方法。

背景技术

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），俗称南美白对虾（Penaeus vannamei），属节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亚目（Natantia）、对虾科（Penaeidae）、对虾属（Penaeus）、Lito-penaeus亚属，是广温广盐性热带虾类，是目前世界上三大养殖对虾（中国对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾）中单产量最高的虾种，在对虾渔业及养殖业中占有重要地位。

1988年7月，凡纳滨对虾由中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进我国，1992年8月人工繁殖获得了初步的成功，1994年通过人工育苗获得了小批量的虾苗，1999年深圳天俊实业股份有限公司与美国三高海洋生物技术公司合作，引进美SPF凡纳滨对虾种虾和繁育技术，成功地培育出了SPF凡纳滨对虾苗。至此，凡纳滨对虾在我国被广泛养殖。

近年来，凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）在我国不论是海水，还是低盐度海水及淡水中养殖都取得了一定的进展。目前，凡纳滨对虾已是我国养殖对虾的绝对优势品种。2007年，我国凡纳滨对虾养殖产量101万吨，占我国对虾养殖产量的80 % , 同年，我国对虾养殖产量126万吨，占世界对虾养殖总产量的 37 %。但病害和养殖使得凡纳滨对虾资源迅速衰减，尤其自90年代虾病爆发以来，凡纳滨对虾养殖业受到重挫，虾病的流行使抗病品系选育成为必要和需要解决的问题。

本发明做出之前，国内外有类似的研究报告，国内中科院海洋研究所徐鹏等（2001）发表的《中国对虾微卫星DNA的筛选》，张留所（2006）等发表的《凡纳滨对虾分子标记筛选、连锁图谱构建和QTL定位》国外Franklin Pérez等（2005）在凡纳滨对虾中找到了112对微卫星，目前，利用微卫星标记在凡纳滨对虾多态性图谱的构建、特异性遗传标记等方面的应用尚未报道。

发明内容

本发明的目的是为了简便快速的鉴定凡纳滨对虾fx151遗传标记基因座位的遗传变异图谱，丰富现有的凡纳滨对虾微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记，提供了一种凡纳滨对虾fx151微卫星DNA标记鉴定fx151遗传变异图谱的方法。

本发明是通过以下方案实现的：一种凡纳滨对虾fx151微卫星DNA标记鉴定fx151遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤：首先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx151微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx151遗传标记基因座位的的多态性遗传变异图谱（如图1所示）。

提取凡纳滨对虾基因组DNA，将其稀释成50ng/ul，每个反应加入1ul，反应总体积为20ul。

fx151微卫星DNA序列的特异性引物核苷酸序列分别为：正链 5’- TGCCAATAAACAAGTTGAGCC -3’，负链 5’- GTTACTCATTACTTGCCTTCC -3’，退火温度为50℃。

其PCR反应加样参数为：正反向引物各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 2.0 mM Mg²⁺, 0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul。使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性 30s，50℃退火1 min，72℃延伸 1 min，重复这个循环35次；之后延伸5 min，4 ℃保存。