[发明专利]苔藓表达促进区域

说明书

本申请是申请号2004800229689，申请日为2004年7月30日的同名专利的分案申请。 

本发明涉及分离的核酸分子，这些分子促进多肽在遗传修饰的真核宿主细胞中的表达。 

蛋白质类物质(蛋白质、肽、多肽及其片段，以及这些分子的翻译后修饰的形式，在此后被称为“多肽”，在例如实施例部分中与“蛋白质”作为同义词一同使用)在遗传修饰的细胞中的表达是提供这些通常是稀缺或者贵重物质制备物的主要来源。为了在遗传修饰的宿主细胞中表达这些多肽，需要有对这一表达有正面控制(“激活”、“促进”)的DNA区域的存在。启动子是这种区域的重要实例，它们使RNA聚合酶结合到DNA上，起始DNA转录为mRNA(Watson等人，″Recombinant DNA″(1992)，Chapter I.1和2)。 

作为研究植物生理和发育的有用研究对象，苔藓(moss)吸引了越来越多的注意力，因为它们简单的特征(苔藓位于高等植物进化的最底部)为高等植物的复杂生物学提供了信息。苔藓简单的形态学和具有优势的培养可能性使它们成为研究植物生理学和发育生物学流行的模型生物。苔藓可以毫不费力地使用包括纯性培养(axenicculture)在内的体外技术，在控制的条件下培养，不仅仅在培养皿中而且在液体培养基例如生物反应器中。单倍体的配子体可以在无菌的培养基中进行光自养生长，并且很容易在细胞水平观察到。 

苔藓的另一个主要优势是它们的转化能力：尽管有很多研究，但是在植物中的靶向整合事件很少达到10^-4，这阻碍了植物功能基因组学的基因靶向方法的一般使用。与所有其他至今被检测的植物相比，同源DNA序列在苔藓(特别是已经建立的苔藓模型生物例如小立碗藓 (Physcomitrella patens)(其分子遗传学的综述参见Reski，1999))的基因组中的整合主要是以同源重组的方式出现在靶向的位置上。通常使用PEG介导的原生质体摄取质粒DNA、粒子枪法DNA转移、电穿孔以及显微注射(Cove等人，1997)进行苔藓的转化，这些很容易进行。根据转化构建体的设计主要会出现随机或者靶向的整合。 

尽管使用苔藓作为科学工具用于植物生理学研究，但是至今为止使用苔藓在苔藓细胞中制备异源重组多肽仍然是相当有限，尽管已经具备了有效的制备方法(例如根据EP 1 206 561 A中的描述培养原丝体苔藓组织)。 

在真核宿主细胞特别是动物细胞或者高等植物细胞中转化技术的一个主要限制总是缺少有效的启动子用于在这样的宿主细胞中进行外源基因的高的组成型表达。基于这个目的，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子已经被广泛地用于许多植物转化系统中(参见例如WO01/25456A)，但是在一些植物物种中CaMV 35S启动子活性低(特别是单子叶植物例如水稻(McElroy等人，1991，))。对于单子叶植物的转化，已经使用了水稻肌动蛋白15′区域用于蛋白质的异源表达(McElroy等人，1991，)。但是仍然存在对新型表达促进手段的不断需要用于在遗传修饰的真核宿主细胞中表达重组(外源)多肽。 

对于苔藓，特别是小立碗藓至今为止仍然没有发表同源的(在这里同源的定义是苔藓来源的)适当的来自细胞核的表达启动子或者其他来自细胞核的表达启动序列(Holtdorf等人，2002)。研究人员因此已经使用了异源的(在这里异源的定义是非苔藓来源的)启动子用于表达选择标记基因和其他目的基因。但是这些启动子中只有很少能够在某些苔藓中可靠地起作用(例如CaMV 35S启动子；在Holtdorf等人，2002中予以总结；CaMV 35S启动子在某些其他的物种中不起作用(Zeidler等人，1999)；TET-启动子(在Reski(1998)中予以综述)。 

因此，已经在本领域内开发了用于对苔藓进行遗传操作的其他方法，例如基因捕获和增强子捕获系统(Hiwatashi等人，2001；但是还使用了(缩短的)CaMV 35S启动子；作者在瞬时表达实验中表明这个35S启动子的缩短形式是作为一个弱启动子起作用；实际上，这篇文章涉及了在增强子捕获菌株中表达报告基因，但是没有显示这一表达与任何苔藓的调控元件有任何联系)。