[发明专利]真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法

说明书

所属领域： 

生物医药范畴，更确切说是应用人工合成显色基质，利用真菌细胞壁成分(1-3)-β-D葡聚糖激活东方鲎血细胞裂解物中G因子，从而水解合成显色基质Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)进而发生缩合反应而定量检测(1-3)-β-D葡聚糖方法及相关应用于临床诊断深部真菌感染的产品。 

背景技术：

经初步检索，未查到以人工合成显色基质Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)制备成比色检测真菌细胞壁成分(1-3)-β-D葡聚糖试剂专利。 

发明内容：

本发明是以人工合成显色基质Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)利用微量(1-3)-β-D葡聚糖特异性地激活东方鲎血细胞裂解物中含有的G因子、凝固酶原及凝固蛋白原，从而诱发东方鲎血细胞裂解物凝固化反应。被激活的凝固酶水解合成显色基质释放出显色基团DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)，DIAN与1-萘酚-4-磺酸钠、(1-萘酚-2-磺酸钠或1-萘酚-5-磺酸钠)在高碘酸钠存在下生成蓝色缩合物，在630-680nm波长处，酶原激活量与形成的缩合物的吸收度在一定范围内呈线形关系，从而定量检测出样品中(1-3)-β-D葡聚糖浓度。该试剂盒可以用来早期诊断临床深部真菌感染。参照说明书附图将本发明内叙述如下： 

一、合成显色基质 

采用生物技术人工合成Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)类显色基质。具体合成工艺(见工艺路线图)。 

二、东方鲎血细胞裂解物提取、分离 

2.1血细胞裂解液配制：其中裂解液中成分应含有Na⁺，Mg²⁺，Ca²⁺等金属离子，调节pH后并进行121℃90分钟灭菌处理后方可使用。 

2.2血细胞裂解：无菌操作，取约20g血细胞，按照1-5比例加入血细胞裂解液，并用高速均浆机进行200000rpm/min，5-10分钟破损细胞，将破损后的组织细胞液放入-30℃冰箱内快速冷冻保存10小时，之后将冷冻细胞液取出，在室温下缓慢溶解，待全部溶解后，再用高速组织均浆机进行200000rpm/min，5-10分钟破损细胞，然后将破损后的组织细胞液再次放入-30℃冰箱内快速冷冻保存10小时，重复上次过程2遍即可。 

2.3血细胞分离、提取：将上述血细胞裂解液取出后进行3000rpm/min，5-8分钟离心，取上清液，按照1-2比例加入氯仿，剧烈震荡10分钟，然后转移至无热原离心沉淀管中在4℃下进行10000rpm/min，5-10分钟分离，仔细取出上清液备用。 

三、显色合成基质及缩合溶液的配制及处理 

1、显色合成基质溶液配制 

将显色合成基质用灭菌注射用水溶解，配制成6mM浓度，使用0.22um滤膜过滤，4℃保存备用。 

2、显色液A 

为6mM的1-萘酚-4-磺酸钠溶液(使用pH 8.5浓度为0.05mol的硼酸缓冲液配制)。 

3、显色液B 

为2％高碘酸钠溶液(使用注射用水配制)。 

4、显色液A及显色液B处理 

将上述显色液A及显色液B配制后，分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。 

5、显色合成基质溶液处理 

将显色合成基质溶液，分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。 

四、反应主剂的制备与标定 

1、取提取、分离好的东方鲎血细胞的上清液，加到含有1.0M氯化镁0.5M氯化钙溶液中，分装至西林瓶或安瓿瓶中进行冷冻干燥即为反应主剂。 

2、取上述冷冻干燥好的反应主剂，按照标示值加入溶解液使其完全溶解，然后用灭菌注射用水1-10倍稀释，用紫外分光光度计检测，应在270±3nm处有吸收峰。 

3、将(1-3)-β-D葡聚糖标准品用溶解液溶解并稀释成最终浓度为100pg/ml溶液，与反应主剂反应，应出现反S型检测峰。 

五、(1-3)-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的性能